猪星状病毒细胞受体的筛选和鉴定

Our previous studies showed that high prevalence of porcine astrovirus in swine herds was detected by RT-PCR. Two strains of porcine astrovirus named PAstV1-NNJG7 was isolated and identified in PK-15 cells inoculated with suspension of astrovirus-positive tissue. Piglets challenged with porcine astrovirus (PAstV1-NNJG7 and PAstV1-GX1) showed diarrhea and loss of weigh, threatening development of swine industry. In this proposal, membrane proteins of PK-15 will be isolated and purified by density gradient centrifugation procedures and aqueons two-phase system. The candidate cellular receptor will be screened by VOPBA、CO-IP and emulsion-chemical cross linking method and further identified by RNAi and receptor reconstruction. Our studies will enhance our understanding the location and distribution and transmission and pathogenicity of porcine astrovirus.

我们前期研究工作表明，猪星状病毒在国内猪群有着较高的流行率，并将阳性材料在PK-15细胞中连续传代分离出两株具有较高生长滴度的猪星状病毒 (PAstV1-NNJG7和PAstV1-GX1)，致病性实验表明病毒感染仔猪出现轻微腹泻，增重减少，说明猪星状病毒危害着猪养殖业。目前，国内外对星状病毒的流行病学和诊断技术的研究较多，尚未对猪星状病毒细胞受体的进行研究的报道。本课题中，拟通过梯度密度离心和多聚物双水相方法提取PK-15细胞质膜，提取膜蛋白。采用病毒铺覆蛋白印迹（VOPBA）、免疫共沉淀（CO-IP）和蛋白化学交联等方法筛选病毒候选受体。再用病毒受体重建、RNAi技术进一步鉴定候选受体。本研究为阐明猪星状病毒定植、分布、传播和致病的分子机制提供科学依据。

猪星状病毒是一种单股正链RNA病毒，属星状病毒科星状病毒属，有五个基因型。目前猪星状病毒在全球范围广泛流行，在国内猪群中也普遍存在，致病性实验表明病毒感染仔猪后会出现腹泻，减重，肠绒毛萎缩等病变，说明猪星状病毒具有一定致病性，对养猪业造成危害。近些年来不断有学者发现人、其他动物星状病毒与猪星状病毒之间发生了基因重组以及跨种间传播的现象，表明猪星状病毒具有重要的公共卫生意义。但目前，对猪星状病毒复制相关机制的研究很少，国内外尚未有关于猪星状病毒细胞受体及其复制有关的蛋白质研究报道。本实验通过病毒分离得到两株猪星状病毒1型毒株，运用病毒浓缩；病毒覆盖免疫印迹；质谱分析，siRNA抑制，真核表达等实验技术进行筛选，发现猪天青杀素1/肝素结合蛋白（AZU1/HBP）与猪星状病毒的复制有重要关系，通过对猪天青杀素蛋白不同靶位点设计三对siRNA引物，转染PK15细胞抑制蛋白表达后病毒在感染前期（12hpi）RNA表达量与对照组相比下调一个数量级。之后将猪天青杀素蛋白mRNA CDS连接到pGFPN1真核表达质粒上，转染PK15过表达蛋白后病毒RNA表达量与对照组相比有明显上升，由此我们推测猪天青杀素1/肝素结合蛋白（AZU1/HBP）可能是猪星状病毒在PK15细胞上的细胞受体之一。除此之外，我们通过相同的方法还膜联蛋白家族（Annexin）A1蛋白和A2蛋白也对猪星状病毒的复制起到促进作用。综上所述，本研究找到了三个与猪星状病毒复制相关的蛋白质，为接下来进一步研究猪星状病毒感染过程，复制机制提供了科学依据。