仿刺参“化皮”体壁组织DNA甲基化分析及DNMT1与miR-148a/miR-152相互调控机制研究

Our previous study results showed that DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and methyl-CpG binding domain protein MBD2 and MBD2/3 expressed differentially during the "skin ulceration" of Apostichopus japonicus. Moreover, the DNMT1 expression was significantly negatively correlated with the expressions of miR-148a and miR-152. In this study, whole genome bisulfite sequencing (WGBS) will be conducted on the body wall tissues of healthy and “skin ulceration” individuals. By constructing and comparing the DNA methylation profiles, the differentially methylated regions (DMRs) will be screened. Genes with DMRs will be compared to differentially expressed genes (DEGs) in transcriptome analysis, and the relationship between methylation sites or methylation level and the expression level of DEGs will be revealed. The expression patterns of DNMT1, MBD2 and MBD2/3 in the body wall of A .japonicus at different stages of “skin ulceration” will be analyzed, and the correlations between these methylation enzymes and DEGs will be tested. Based on the comprehensive analysis of the reciprocal regulation between DNMT1 and miR-148a/miR-152, the mechanism of reciprocal regulation between DNA methylation and microRNA in the body wall of A.japonicus suffered "skin ulceration" will be studied.

项目组前期研究表明，仿刺参(Apostichopus japonicus)“化皮”过程中，DNA甲基转移酶DNMT1和甲基化结合蛋白MBD2、MBD2/3在“化皮”体壁组织中异常表达，并且DNMT1与miR-148a和miR-152的表达显著负相关。本研究拟通过对健康和“化皮”仿刺参体壁组织的全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），构建DNA甲基化谱，筛查差异甲基化区域（DMRs），对DMR相关基因与转录组差异表达基因进行关联分析，解析差异甲基化位点及甲基化水平与差异表达基因之间的关系；对DNMT1和MBD2、MBD2/3基因在仿刺参“化皮”体壁组织中的表达特征进行分析，验证它们对差异表达基因的调控作用；综合分析DNMT1对编码miR-148a和miR-152基因的调控，以及miR-148a和miR-152对DNMT1基因转录后表达调控作用，探索仿刺参中miRNA与DNA甲基化的相互调控机制。

为了探索仿刺参“化皮”过程中的表观遗传调控机制，首先，本项目开展了仿刺参“化皮病”体壁组织DNA甲基化的MSAP分析，发现病变体壁总甲基水平和全甲基化水平均显著高于健康体壁和“化皮病”正常体壁，表明仿刺参体壁的“化皮”与DNA甲基化相关。随后，本项目开展了仿刺参“化皮病”体壁组织和健康体壁组织的全基因组甲基化测序。在此基础上，构建了DNA甲基化谱。GO富集结果显示，包含DNA甲基化过程的DNA为模板的转录调控在生物过程中最显著富集，因此其富集的NLK等基因值得关注。通过对甲基化组和转录组的关联分析，共发现了10,499个差异甲基化位点（DMRs）和496个差异表达基因（DEGs）呈负相关关系。KEGG信号通路分析发现上述负相关的DEGs主要富集在PI3K/Akt/mTOR信号途径上。通过构建关键差异甲基化基因调控网络，发现NLK和mTOR在调控网络中占据关键位置，表明这两个基因甲基化变化与仿刺参的“化皮”感染和免疫调控密切相关。另外，本项目还初步分析了仿刺参中DNA甲基化对基因表达的作用途径，发现DNMT1基因抑制表达后，MBD2/3和DMAP1的表达显著下调，且MBDs能够与NLK、mTOR等关键调控基因的甲基化位点结合互作，表明在仿刺参中DNA甲基化可能是通过DNMT1、DMAP1和MBD2/3的协同作用来调控基因表达的。最后本项目开展了DNMT1与miRNA的相互调控机制研究。以DNMT1上3’UTR区为靶位点，预测出靶向调控DNMT1的miRNA为miR-318。通过双荧光素酶报告系统实验、miR-318过表达和抑制表达分析以及DNMT1抑制表达分析发现，miR-318可以靶向作用于DNMT1的3’UTR区；miR-318过表达引起DNMT1、MBD2/3和DMAP1的表达显著下调；miR-318抑制表达导致DNMT1、MBD2/3和DMAP1的表达明显上调；DNMT1抑制表达导致miR-318的表达显著上调。这表明miR-318能够直接调控DNMT1，并引起DMAP1和MBD2/3产生相同的变化，从而参与甲基化调控。另外，DNMT1的下调表达可能导致编码miR-318基因的去甲基化，从而使miR-318表达水平上调，反映出DNMT1与miR-318之间存在着反馈调控机制。