仿刺参“化皮”过程转录组差异mRNA和miRNA的动态表达谱及调控网络分析

"Skin ulceration" is a main epidemic disease in the indoor and outdoor culture of sea cucumber Apostichopus japonicus. Some studies indicated that many bacteria pathogen, such as Vibrio splendidus, can induce the "skin ulceration". The immune response during "skin ulceration" is a complicated and dynamic procedure affected by many factors and is regulated by multiple genes. To study these differentially expressed genes and their relationship in "skin ulceration" is necessary to learn the defense mechanism of A. japonicus. In this study, we plan to sequence the transcriptome of A. japonicas by RNA-Seq, and detect the differentially expressed mRNA and miRNA between the healthy individuals and "skin ulceration" individuals at different infected stages. In addition,we will study the signal pathway of these differentially expressed genes, and analyze the correlation between the dynamic expression patterns of these genes and "skin ulceration". Furthermore, we will construct the miRNA-target genes regulatory network by docking analysis of the differentially expressed mRNA and miRNA. Our study will be useful to the disease prevention of sea cucumber "skin ulceration"caused by bacteria pathogen.

"化皮病"是仿刺参(Apostichopus japonicus)在室内及池塘养殖期间的主要流行病。研究表明，灿烂弧菌（Vibrio splendidus）等多种病原菌都能引起仿刺参的"化皮病"。仿刺参"化皮"过程的免疫应答是一个多基因调控的、多因素参与的、动态的复杂过程。深入研究"化皮"过程中差异表达基因以及这些基因之间的相互作用，是仿刺参免疫防御机制研究的基础。本研究拟通过RNA-Seq对仿刺参"化皮"不同阶段进行转录组测序和动态表达谱分析，筛选仿刺参"化皮"过程中的差异表达基因（mRNA）和差异miRNA，研究这些差异表达基因作用的信号通路；分析差异基因和miRNA动态表达模式与"化皮"程度的关系；通过预测差异miRNA的靶基因，以及对仿刺参"化皮"各阶段的转录组差异mRNA和miRNA 进行对接分析，构建miRNA-靶基因调控网络，为病原菌引起的仿刺参"化皮病"的防控提供科学依据。

本研究通过灿烂弧菌（Vibrio splendidus）感染，构建仿刺参“化皮病”试验群体，对病变早期（SUS-I）、中期（SUS-II）和后期（SUS-III）的组织分别进行了转录组测序（mRNA和miRNA测序）。差异表达基因分析结果显示，“化皮”群体与健康群体相比，体壁间的差异远远大于肠、呼吸树、体腔细胞之间的差异。在此基础上，对常规养殖环境中健康仿刺参和病原感染环境中正常仿刺参的体壁组织及“化皮病”（SUS-I、SUS-II、SUS-III）的病变体壁组织同时进行了转录组重测序和iTRAQ蛋白质组定量分析。筛选出仿刺参“化皮”过程中重要差异表达基因92 个：细胞黏附与病原体识别 （17 genes）、 免疫反应（38 genes）、氧化应激（7 genes）和细胞凋亡（30 genes）。通过iTRAQ蛋白质组定量分析，筛选出仿刺参“化皮”过程重要差异表达蛋白79 个：免疫相关（28 proteins）; mRNA转录后修饰（4 proteins）、 mRNA稳定性（6 proteins）、代谢相关（19 proteins）、 运动相关（2 proteins）、发育相关（10 proteins）及其他（10 proteins）；这些差异表达基因（蛋白）参与了免疫应答、细胞凋亡、信号转导、细胞骨架、代谢、发育等多条与“化皮”过程“内在”和“表观”密切相关的信号通路。miRNA测序分析，共得到1775个unique miRNA，其中247个保守miRNAs，10个新型miRNAs，并筛选出调控仿刺参“化皮”过程中免疫、细胞凋亡、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、去乙酰化和组蛋白甲基化基因相关的miRNAs。通过构建“化皮”相关差异表达 miRNA和差异表达基因的调控网络，筛选到关键基因IgGFc-binding protein，Tenascin，Caspase，NFKB，Titin等；关键调控作用的miRNA包括miR-2013-3p，miR-34-3p，miR-31-5p，miR-22-3p，miR-29b-3p，miR-184，bantam等。尤其值得关注的是DNA甲基化修饰系统中的DNA甲基转移酶DNMT1、DNA 甲基化相关蛋白DMAP1和甲基化结合蛋白MBD2、MBD2/3基因在仿刺参“化皮”体壁组织中均显著高水平表达，并预测到与miRNA的调控相关。