抗HIF-1α纳米抗体靶向治疗胰腺癌的实验研究

Hypoxia-inducible factor 1α (HIF -1α) is a kind of nuclear transcription factor, which can show its transcriptional activity under hypoxic circumstances. The constitutive expression of HIF-1α was found in pancreatic cancer cells in the preparatory work. Intracellular antibody may be the only way to block HIF -1α pathway, and then to treat pancreatic cancer. The nanobodies have the molecular weight of about 15kDa, which are one-tenth of the size of conventional mAbs. They lack of hydrophobicity and was investigated good resistants to heat, acid and alkali. They also can keep well their binding force under the conditions of strong reduction. Base on the construction of high capacity nanobodies library derived from non-immune alpaca and screening of anti-HIF-1α VHH antibodies, the project focuses on the research of the antitumor activity of anti-HIF-1α VHH intracellular antibodies, in order to make the VHHs to be new therapeutical antibody drugs with independent intellectual property right for the treatment of pancreatic cancer in the nearly future.

乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)是一个缺氧状态下发挥活性的核转录因子，最新文献报道和申请者前期工作中发现HIF-1α组成型表达于胰腺癌细胞。以往常规抗体靶向亚细胞部位困难，无法作为胞内抗体通过阻断HIF-1α通路来治疗胰腺癌。申请者前期制备的澳洲羊驼alpaca纳米抗体（nanobody）大小仅为完整抗体的十分之一，且不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，在还原环境中仍能很好的维持其抗原结合能力。为此，申请者提出以HIF-1α为靶标,筛选得到anti-HIF-VHH binder；在此基础上，本研究拟构建编码细胞核定位的anti-HIF-VHH胞内抗体基因的真核表达载体，转染胰腺癌细胞，观测其表达、定位及抑瘤效应，来探讨纳米抗体作为细胞内抗体用于特异性阻断靶蛋白、发挥抗肿瘤作用的可行性；并构建人胰腺癌裸鼠模型进行体内实验，以进一步验证该抗体疗效,为胰腺癌的生物治疗提供新思路和新靶点。

在胰腺癌的肿瘤微环境当中，以上位调控因子HIF-1为主导的转录调控机制在胰腺癌细胞增殖，转移，耐药等多重生物学行为中起到了至关重要的作用。本课题旨在开发anti-HIF-1α VHH胞内抗体，用于特异性拮抗乏氧诱导因子的亚基HIF-1α，从而抑制在胰腺癌中因为HIF-1高表达造成的肿瘤耐药效应，促进肿瘤对化疗药物的敏感性，进而调节胰腺肿瘤免疫微环境的重塑，以期达到提高患者预后的目的。首先利用多种驼科动物外周血淋巴细胞，构建高库容的纳米抗体天然库，并使用噬菌体展示技术和核糖体展示技术筛选得到对HIF-1α的PAS-B抗原决定簇具有较高亲和力的纳米抗体序列。与此同时，尝试了利用通过高通量测序比对构建的模拟纳米抗体合成文库进行anti-HIF-1α binder的筛选工作。为满足后续的实验需要，我们初步搭建了适宜纳米抗体的体外亲和力平台，对筛选得到的纳米抗体序列进行体外亲和力成熟，从而得到了亲和力更高，热稳定性更强的突变体序列VHH212-mut。在此基础上对优化的纳米抗体序列进行进一步的修饰工作，提高其异源表达产量和稳定性。进而通过WB，SPR和Pull Down实验，验证VHH212-mut的亲和力和免疫活性，并通过计算机分子模拟技术阐述VHH212-mut在胰腺癌细胞系内对HIF-1α拮抗的分子动力学机制。随后优化anti HIF-1α VHH 胞内抗体的真核表达载体，在乏氧条件下应用WB，Q-PCR，双荧光素酶报告基因等实验手段验证anti HIF-1α VHH 胞内抗体能够拮抗HIF-1α，从而阻断乏氧诱导因子-1的转录调控作用。最后通过构建BALB/c裸鼠异种移植模型，进一步证明了阻断HIF-1α的转录调控作用能够增加肿瘤对于胰腺癌一线化疗药物吉西他滨的敏感性。本项目研究成果为胰腺癌肿瘤的生物治疗提供了新的思路，同时也为靶向胰腺导管腺癌的肿瘤临床精准治疗提供了理论基础。