基于ERS-PI3K/Akt/mTOR-自噬轴探讨益气除痰方干预EGFR-TKIs获得性耐药机制研究

EGFR-TKIs has become a sensitive mutant EGFR first-line medication of patients with locally advanced NSCLC .But the mechanism of the resistance of EGFR-TKIs is not clear which is make the treatment of NSCLC become more difficult. Our previous research showed that: YiQi ChuTan prescription can improve the sensitivity of EGFR-TKIs acquired drug resistance, because of decreasing the UPS related molecular chaperone protein expression, increasing the endoplasmic reticulum stress and apoptosis. In this study, we will discuss the mechanism of the effect of YiQi ChuTan Formula intervene EGFR-TKIs acquired drug resistance based the"ERS-PI3K/Akt/mTOR-autophagy"axis. we will detect the expression level of " ERS-PI3K/Akt/mTOR-autophagy" axis signal pathway via electron microscopic perspective, a real-time quantitative RT-PCR, Western blot and other technical methods, definite the mechanism of the EGFR-TKIs acquired drug resistance . Then eliminate the effect of the traditional Chinese medicine YiQi ChuTan Formula on these signal pathways via the gene expression, siRNA technology, observe if there have any change in the regulation of signal pathways, to make clear the targets of YiQi ChuTan Formula .

EGFR-TKIs现已成为EGFR敏感突变型中晚期NSCLC患者的一线用药，然而至今尚未阐明EGFR-TKIs耐药产生的机制，为NSCLC的治疗带来困难。研究表明：益气除痰方可通过增强内质网应激(ERS)，上调ERS反应性凋亡提高耐药细胞对EGFR-TKIs的敏感性。本项目拟在前期研究基础上，引入对ERS-PI3K/Akt/mTOR-自噬轴的分子机制研究，应用透视电镜、实时定量 RT-PCR、免疫荧光、Western blot等方法，检测该轴相关信号分子的表达和活性，明确EGFR-TKIs获得性耐药发生的可能机制；同时观察中药益气除痰方对肺癌耐药细胞ERS-PI3K/Akt/mTOR-自噬轴相关信号分子的影响，采用基因过表达、siRNA等技术扩大或消除益气除痰方对这些阳性通路的影响，观察其对ERS-PI3K/Akt/mTOR-自噬轴调节作用的变化情况，以明确益气除痰方的作用靶点。

EGFR-TKIs现为EGFR敏感突变型中晚期NSCLC患者的一线用药，但至今未完全阐明其耐药产生机制，为治疗带来困难。益气除痰方是经长期临床研究证实具有协同EGFR-TKIs治疗NSCLC增效作用的有效方剂，在延缓耐药、降低疾病进展风险方面具有明显疗效。为研究益气除痰方是否通过调控内质网应激(ERS) -PI3K/Akt/mTOR-自噬以协同EGFR-TKIs增效，本研究首先通过体内研究，以EGFR-TKIs耐药的H1650及H1975 NSCLC细胞建立耐药荷瘤裸鼠模型，使用益气除痰方、吉非替尼（GE）及联合用药干预，观察裸鼠一般情况、肿瘤生长及瘤重，应用透射电镜观察内质网及自噬体，免疫荧光、western blot检测细胞凋亡、ERS及PI3K/Akt/mTOR-自噬相关蛋白表达，证实益气除痰方联合GE可显著降低耐药荷瘤裸鼠的瘤积和瘤重，从而达到逆转耐药的效果，其作用机制与内质网应激凋亡及自噬相关。其次，XTT、EdU、流式细胞术检测证实，益气除痰方联合GE可显著降低耐药细胞H1650及H1975细胞活力，抑制细胞增殖；应用电镜、免疫荧光、western blot、qPCR，检测益气除痰方联合GE可下调GRP78、PDI等分子伴侣，调控PERK信号通路，增强ERS，促进凋亡，同时下调PI3K/Akt/mTOR和上调自噬通路蛋白表达。最后，使用ERS抑制剂TUDCA，观察到益气除痰方抑制细胞增殖能力减弱，下调GRP78、PDI、PERK程度减弱；使用mTOR抑制剂雷帕霉素，进一步表明益气除痰方具有下调PI3K/Akt/mTOR和上调自噬通路的作用。通过以上实验明确，益气除痰方联合GE可显著降低NSCLC耐药细胞H1650及H1975的细胞活力和细胞增殖能力，抑制耐药荷瘤裸鼠肿瘤生长，达到逆转耐药。增强ERS，抑制未折叠蛋白反应，激活PERK通路，促进凋亡，同时下调PI3K/Akt/mTOR和上调自噬通路是逆转EGFR-TKIs耐药的主要机制。这也表明中医药治疗肿瘤为多靶点作用，符合中医药整体调节的特点，对中医药抗肿瘤机理研究理论创新具有重要意义。此外，在本项目计划的基础上，增加了部分新的研究内容，对益气除痰方主要成分进行液相色谱分析及分子对接，推测异鼠李素、贝母尼丁、迷迭香酸等为可能的抗肿瘤活性物质，为进一步明确中药复方抗肿瘤成分研究提供了思路和基础。