益气除痰方调控内质网应激与UPR诱导肺癌细胞凋亡的研究

Regulation of endoplasmic reticulum stress (ER stress) and unfolded protein response (UPR) is currently the research focus of cancer treatment at home and abroad, but few study of traditional Chinese medicine in this term have been reported."Sputum, asthenia "is the main pathogenesis of lung cancer. Under the guidance of traditional Chinese medicine "holistic concept", the treatment of lung cancer should primarilybenefit vital energy and eliminate phlegm. "Yiqi Chutan Formula"is found on this principle.The efficacy of "Yiqi Chutan Formula" for treatment of lung cancer has been confirmed by two multi-center clinical trials.In the previous study funded by National Natural Science Foundation（30772862）charged by the applicant，we discovered YQCTF can down-regulate the expression of some protein related to protein folding of UPR and increase ER stress,suggesting that YQCTF induced lung cancer cells apotosis through regulating of ER stress and UPR. To carify this mechanism of YQCTF,we intend to observe the change of ER stress、UPR（protein synthesis, folding, degradation）、endoplasmic reticulum stress induced-apoptosis under the effect of YQCTF. Then use siRNA to validate the target influenced by YQCTF which induces cell apotosis.This study is based on the "holistic concept"of TCM and previous proteomic research with whole characteristic .It will make a new important theory complement to "whole regulation"of Chinese medicine anti-cancer mechanism.

调控内质网应激与未折叠蛋白反应（UPR）诱导肿瘤细胞凋亡是当前国内外肿瘤治疗的研究热点，但中药复方调控内质网应激与UPR抗癌的研究很少涉及。"痰、虚"是肺癌的主要病机，治疗肺癌须健脾益气，除痰散结。"益气除痰方"是经长期临床研究证实治疗肺癌的有效方剂。前期研究表明该方可明显诱导肺癌细胞凋亡，以蛋白质组学研究发现"益气除痰方"可下调UPR相关蛋白质折叠所需的多个分子伴侣表达，增强内质网应激，提示该方可能通过调控内质网应激及UPR诱导细胞凋亡治疗肺癌。本研究拟进一步从内质网应激、UPR（蛋白质合成、折叠、降解）、内质网应激凋亡通路三方面深入探讨"益气除痰方"对"内质网应激反应"这一相对独立完整的信号通路网络的干预机制，阐明其抗肺癌的机理；并采用siRNA等技术反向验证该方诱导细胞凋亡的作用靶点。本研究符合中医"整体观念"和中药"整体调节"的特点，将为中药复方"整体调节"优势提供新的理论依据。

调控内质网应激与未折叠蛋白反应诱导肿瘤细胞凋亡是当前国内外肿瘤治疗的研究热点，益气除痰方是经长期临床研究证实治疗肺癌的有效方剂。为验证益气除痰方是否通过调控内质网应激与未折叠蛋白反应诱导肿瘤细胞凋亡来治疗肺癌，本研究首先通过体内研究部分，以前期研究已建立的A549肺腺癌种植瘤裸鼠模型为研究对象，通过观察给药后裸鼠的一般情况、肿瘤生长情况、生存时间、荷瘤裸鼠肺转移结节个数，以及应用免疫组化检测瘤体组织内质网应激及凋亡相关各蛋白表达，证实了益气除痰方对A549细胞种植裸鼠的肿瘤具有抑制作用，其作用机制与内质网应激凋亡与未折叠蛋白相关；其次，通过MTT、流式细胞技术检测证实，益气除痰方可促进A549肺腺癌细胞凋亡及抑制增殖，且益气除痰方可通过下调GRP78、P4HB、PDIA3等分子伴侣，激活未折叠蛋白反应中PERK-eIF2α信号通路；应用RT-PCR检测Caspase-4基因在A549细胞中的表达水平，并通过化学抑制剂Z-LEVD-FMK抑制后，可证实益气除痰方可通过上调Caspase-4的表达促进A549细胞的凋亡，但并非唯一途径，我们推测益气除痰方诱导细胞凋亡除Caspase-4途径外，尚包含其它信号通路参与；最后，通过Western blot，RT-PCR等方法检测证实，益气除痰方可明显提高A549细胞CHOP蛋白及 mRNA表达，可通过下调bcl-2，上调Bax mRNA表达以促进A549细胞凋亡，并通过构建CHOP siRNA质粒并转染A549细胞，沉默CHOP基因的表达，观察到益气除痰方上调CHOP能力下降，促进细胞凋亡能力减弱，明确益气除痰方通过CHOP、Caspase-4共调控A549细胞凋亡。通过以上实验明确益气除痰方可激活内质网应激凋亡信号通路促进肿瘤细胞凋亡，证实中医药治疗肿瘤多为多靶点治疗，本研究符合中医药整体调节的疗效特点，将对中医药抗癌机理进行全新的科学诠释，对中药抗癌机理研究理论的创新具有一定的推动作用，研究成果具有重要理论意义。此外，在本项目计划的基础上，本研究增加了部分新的内容，包括对益气除痰方的主要成分进行质谱析（正在进行中），以明确中药复方抗肿瘤主要成分；以及根据益气除痰方开发研制院内制剂YFSJW，已完成制备工艺、质量标准、稳定性的研究，并已申请专利，为进一步实现中医药治疗肿瘤的转化研究奠定了基础。