基于STAT3/HIF-1α/BNIP3信号通路调控线粒体自噬探讨益气除痰法干预CRF的作用机制

Cancer-related fatigue (CRF) is one of the most common and painful symptoms of cancer patients, influences the prognosis of cancer patients and the quality of life seriously. The causes and mechanisms of CRF have not yet to clarify, which causes the lack of the prevention and treatment of CRF. Previous studies confirm the exact curative effect of Yiqi Chutan prescription on CRF, the mechanism are related to the suppress of inflammatory cytokines and excessive activation of mitophagy, but the relations between the two aspects are not yet clear. In this project, we propose a hypothesis that chronic inflammatory microenvironment will sustain activation of STAT3 / HIF-1 alpha/BNIP3 signaling pathways, inducing excessive activation of mitophagy is the mechanism of CRF, we will build the CRF model in mice in vivo and the tumor inflammatory microenvironment co-culture system in vitro as the research objects, using the perspective electron microscopy (sem), laser confocal microscope, qRT-PCR and Western blot, to detect the inflammatory cytokines, mitophagy, the protein and gene expression of STAT3 / HIF-1 alpha/BNIP3 signaling pathways, cell proliferation and apoptosis of skeletal muscle cells and the lung cancer cells at the different time. And siRNA technology will be used to silence the expression of STAT3 gene, then to observe the change of the protein and gene expression of downstream signaling pathways and mitophagy according to Yiqi Chutan prescription, to verify the hypothesis above and clear the therapeutic mechanism of Yiqi Chutan prescription.

CRF是癌症患者最常见的并发症之一，至今尚未阐明的发生机制，为CRF的防治带来困难。前期研究证实，基于“益气除痰法”组建的肺癌经验方益气除痰方防治CRF确切有效，其作用机制与降低炎症细胞因子和线粒体自噬的过度活化有关，但两者间关系尚未明确。本项目提出慢性炎症微环境持续激活STAT3/HIF-1α/BNIP3信号通路，诱导线粒体自噬过度活化是CRF发生机制这一假说，以体内CRF小鼠模型、体外肿瘤炎症微环境共培养体系为研究对象，利用透视电镜、激光共聚焦显微镜、qRT-PCR、WB等方法，动态检测骨骼肌及肺癌细胞炎症相关指标、线粒体自噬水平、STAT3/HIF-1α/BNIP3信号通路相关蛋白、基因表达及细胞增殖凋亡情况。并应用siRNA技术沉默STAT3基因，观察益气除痰方对下游信号通路相关蛋白及线粒体自噬的调节作用的变化，以验证该假说及明确益气除痰方防治CRF的作用靶点。

癌因性疲乏（CRF）是癌症及治疗最常见最痛苦的并发症之一，严重影响癌症患者的预后及生活质量。至今尚未阐明CRF发生的原因及机制，为CRF的防治带来困难。因此，明确CRF发生的相关机制及寻找有效防治CRF的方法具有重要意义。.本项目分别通过体表接种肺腺癌移植瘤并予以化疗药物的方式建立了移植瘤CRF小鼠模型，以及腹腔注射肺腺癌细胞的方式建立了炎症CRF小鼠模型，以更全面的方式模拟临床常见CRF状态，并以体外肿瘤炎症微环境骨骼肌细胞损伤模型为研究对象，体内外双水平实验探索，①明确了益气除痰方对CRF的药效作用。本项目通过检测负重游泳及旷场实验表明两种模型均可引起小鼠发生CRF，益气除痰方在缓解CRF方面发挥关键作用。通过对小鼠体重、脾脏指数、生化指标、生存周期的检测，阐明益气除痰方可以缓解CRF，并对CRF小鼠有提高化疗敏感性、改善生存质量、延长生存时间的作用。②明确了益气除痰方对荷瘤CRF小鼠的抗肿瘤作用。本项目通过检测小鼠肿瘤体积、肿瘤自噬、凋亡、氧化应激等情况探讨了益气除痰方对CRF小鼠肿瘤的影响。结果阐明，单独应用益气除痰方或联合顺铂DDP使用均可减小肿瘤体积，联合处理的效果最佳，其机制可能与促进肿瘤组织氧化应激，增强肿瘤细胞的自噬和凋亡有关。③明确了益气除痰方防治CRF的作用机制。本项目通过检测各组小鼠骨骼肌电镜下线粒体自噬状态、骨骼肌HE、TUNEL染色、氧化应激指标、自噬相关蛋白、凋亡相关蛋白等指标，结果表明氧化应激和骨骼肌自噬及凋亡可能是CRF发生的机制，益气除痰方可以通过减轻骨骼肌细胞的自噬及凋亡来改善CRF。为进一步明确益气除痰方防治CRF的作用靶点，我们通过RNA测序及分子对接，并建立炎症微环境共培养细胞体系，搭建骨骼肌细胞体外损伤模型进行后续体外实验验证，阐明了益气除痰方及其主要活性成分槲皮素，通过抑制骨骼肌Stat3/HIF-1α/BNIP3信号通路过度激活诱导的线粒体自噬来发挥防治CRF的作用。.通过本项目研究，将进一步深入解析CRF这一重要问题的分子机制，对中医药防治CRF机理理论的创新具有一定的补充及推动作用，为临床应用中医药防治肿瘤相关不良反应提供了实验参考依据，同时也对今后临床干预CRF，提高肿瘤患者生存质量具有重要的现实意义。