新型猪冠状病毒(PEAV)引起宿主细胞凋亡的分子机理研究

Porcine enteric alphacoronavirus (PEAV) was first reported by our team in Guangdong, China in February 2017. PEAV causes diarrhea, vomit and dehydration, and the mortality rate can reach up to 90%, leading to great economic loss to pig industry in China. Our previous data indicates that PEAV as a new pathogen of pigs with strong pathogenicity infection induces apoptosis in vivo and it could be the potential molecular mechanism for intestinal villus loss caused by PEAV infection. However, the molecular mechanism of apoptosis caused by PEAV still unclear. In this study, the eukaryotic expression vectors expressed PEAV viral protein were transfected host cells to analysed and screened the key viral protein(s) to induce host cells apoptosis by flow cytometry. Furthermore, the target protein in host cells with this viral protein(s) interaction were explored by immunoprecipitation, mass spectrometry and confocal microscopy to parse the molecular mechanism of apoptosis induced by PEAV. The results will lay a foundation for determining the virulence factor of PEAV and revealing PEAV pathogenesis, and also provide some clues for us to develop novel vaccines to prevent and control PEAV.

猪肠道α冠状病毒（Porcine enteric alphacoronavirus, PEAV）是由本课题组于2017年在广东首次发现并进行了报道。新生仔猪感染PEAV后出现腹泻、呕吐与脱水，病死率高达90%，给发病猪场造成了巨大经济损失，严重危害我国养猪业的发展。由于PEAV是猪的一种新病原，致病力强，我们课题组在前期研究中观察到PEAV感染宿主引起靶细胞凋亡，导致小肠绒毛脱落，然而PEAV感染引起细胞凋亡的分子机制尚不清楚。本项目以表达PEAV病毒蛋白真核表达载体转染宿主细胞，通过流式细胞术分析不同病毒蛋白对细胞凋亡影响，筛选引起细胞凋亡的关键病毒蛋白，进一步以免疫沉淀、质谱分析以及共聚焦显微镜技术探寻该病毒蛋白互作的靶蛋白，从而解析PEAV引起细胞凋亡的分子机理，为确定PEAV毒力因子和揭示PEAV致病机理奠定基础，也为研制新型疫苗有效防控PEAV提供参考。

猪肠道α冠状病毒（PEAV，目前统一命名为SADS-CoV）为最新发现的猪肠道冠状病毒。新生仔猪感染SADS-CoV后出现腹泻、呕吐与脱水，病死率高达90%，给发病猪场造成了巨大经济损失。作为一种新发的猪肠道冠状病毒，SADS-CoV的致病机制尚不清楚。通过本项目的实施，我们发现，SADS-CoV感染仔猪可以引起肠道发生细胞凋亡，体外实验也证实SADS-CoV感染宿主细胞（IPI-FX、Vero、Hela）可以激活caspase 9/3引起细胞凋亡。进一步将能表达SADS-CoV所有病毒蛋白的真核表达载体转染宿主细胞，通过流式细胞术分析不同病毒蛋白对细胞凋亡的影响证实NS7a为诱导细胞凋亡的关键病毒蛋白，同时构建表达NS7a各截短体的真核表达质粒并转染细胞进行凋亡分析发现，NS7a的第48-54氨基酸为诱导细胞凋亡的关键功能域。这些结果说明NS7a为SADS-CoV的一个关键毒力因子。为了揭示NS7a诱导细胞凋亡的分子机制，我们利用免疫沉淀、激光共聚焦等技术证实，NS7a可以与线粒体凋亡诱导因子（AIFM1）相互作用导致其裂解活化、入核。有趣的是，我们还发现NS7a可以通过与AIFM1相互作用活化Caspase 3，说明NS7a可以通过多种方式诱导宿主细胞凋亡。最后通过siRNA AIFM1或者过表达AIFM1以及加入Caspase 3抑制剂等证实SADS-CoV通过编码NS7a诱导细胞凋亡，进而促进病毒复制。该项目的实施解析了SADS-CoV引起细胞凋亡的分子机制，明确了SADS-CoV毒力因子，这将为揭示SADS-CoV致病机理奠定基础，也为研制有效防控SADS的新型疫苗提供参考。