猪细小病毒（PPV）诱导宿主细胞凋亡信号转导通路的研究

In the process of viral disease, there is the intimate connection between virus infection and apoptosis of host cells. On one hand, virus induces animal disease through apoptosis, on the other hand, animal body clears virus by apoptosis. Previous studies showed that PPV could not only replicate in the placental trophoblasts and delay the fetuses to obtain nutrient through placenta, but also cause atrophy of corpus luteum and affect the secretion of progesterone, resulting in abortion or fetal death. Our research group isolated a PPV strain, which could induce apoptosis to porcine luteal cells and placental trophoblasts in vitro. However, it remains unclear what signal transduction pathway were involved in apoptosis process induced by PPV. In this project, early pregnant sows will be challenged by PPV, and apoptosis will be detected in the corpus luteum and placent tissues. And then, luteal cells and trophoblasts will be infected with PPV in vitro to illustrate the signal transduction pathway of apoptosis induced by PPV, the signal molecules in death receptor pathway, mitochondrial pathway and their upstream regulated pathways, p53 pathways will be checked to reveal the molecular mechanism of PPV causes reproductive failure of sow. The results will lay the foundation for probing the interaction between PPV and host cells, and provide new guidance for the investigation of molecular mechanism to other virus-induced reproductive failure in animals.

在病毒性疾病发生过程中，病毒感染与宿主细胞凋亡之间存在着密切关系，一方面病毒通过诱导细胞凋亡引起宿主发病，另一方面宿主通过细胞凋亡来清除病毒。研究表明，PPV可以在胎盘滋养层细胞中复制，阻碍母体对胎儿营养的传递，还能使黄体发生萎缩，使之失去分泌孕酮功能，导致母猪流产或胎儿死亡。本课题组前期成功分离获得一株PPV，并接种于体外培养的猪黄体细胞和胎盘滋养层细胞，结果发现细胞发生了凋亡。然而它是通过何种分子信号转导通路诱导细胞发生凋亡的，至今尚不清楚。本项目以此为切入点，用PPV攻毒初孕母猪，检测黄体和胎盘中细胞凋亡情况，再用PPV感染体外培养的黄体细胞和胎盘滋养层细胞，最后对死亡受体通路、线粒体通路及其上游的p53通路中信号分子进行检测，揭示PPV引起母猪繁殖障碍的发病机制。研究结果不仅为深入探索PPV与宿主细胞之间的互作关系奠定基础，同时也为研究其他病毒引起动物繁殖障碍的发病机制提供新思路。

猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属病毒，是诱导母猪繁殖障碍的重要病原之一，主要表现为母猪不孕、早期胎儿重吸收、流产、产木乃伊胎和死胎等现象。PPV在全球大部分地区呈地方性流行，在未接种疫苗或疫苗接种不当的猪群中可造成毁灭性的流产风暴。尽管国内外在PPV诱导胎儿或胚胎死亡等方面取得了一定的研究进展，但目前尚无PPV在引起母猪繁殖障碍过程中对母体的影响及相关分子机制的报道。本项目首先用PPV感染PK-15细胞，观察PPV对PK-15细胞凋亡的影响，以及相关凋亡信号转导通路。然后，构建永生化猪胎盘滋养层细胞和黄体细胞，用PPV感染体外培养的胎盘滋养层细胞和黄体细胞，采用PCR或qPCR法确定胎盘滋养层细胞和黄体细胞为PPV感染的宿主细胞，采用AO/EB或Hoechst 33258染色、DNA片段化分析和流式细胞术检测宿主细胞凋亡的发生。接着，检测细胞凋亡通路中Caspase家族成员Caspase-8，-9和-3活化水平，死亡受体通路中死亡受体/配体（Fas/FasL）、线粒体通路中Bcl-2家族成员Bax/Bcl-2和Cyt c凋亡相关分子的表达情况，研究PPV诱导猪滋养层细胞及黄体细胞凋亡的信号转导通路。同时，检测了凋亡信号转导通路上游的p53及MAPKs信号转导通路。最后，以PPV人工感染初孕母猪，通过HE染色、TUNEL染色和原位杂交法验证PPV在黄体和胎盘组织中的分布及诱导细胞凋亡情况。结果证实，PPV感染可诱导初孕母猪黄体组织和胎盘组织发生病变，并引起黄体细胞和胎盘滋养层细胞发生凋亡。PPV是通过激活死亡受体通路和线粒体通路诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡，通过激活线粒体通路诱导猪黄体细胞发生凋亡。PPV诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡过程中，细胞中p53发生积累，且p53第15位和20位丝氨酸发生磷酸化。PPV诱导黄体细胞凋亡过程中p38 MAPK发生磷酸化，并由磷酸化的p38 MAPK诱导p53在细胞中发生积累、转位和转录活性的激活。本研究为揭示PPV引起母猪繁殖障碍的发病机制奠定了理论基础。