猪丁型冠状病毒（PDCoV）复制与宿主细胞自噬相互作用的机制研究

Piglets diarrhea caused by porcine deltacoronaviruse (PDCoV) renders great economic losses in swine industry. PDCoV ecology has not been investigated extensively and the mechanism of viral replication has not been elucidated yet. It has been demonstrated that PDCoV infection can induce autophagy in LLC-PK1 cells in our preliminary studies. On the basis of this phenomenon, we are going to investigate the interacting mechanisms between PDCoV replication and the autophagy of host target cells. In this project, we will establish the PDCoV in vitro infection model and analyze the relationship between the viral replication and autophagy. We are also going to identify the viral proteins that involved in autophagy induction by Co-Immunoprecipitation（Co-IP） and confocal laser scanning microscopy and further confirm their interacting motif(s). The results of this study is conducive for revealing the interaction between autophagy and viral replication, and is aiming at providing insights into the development of novel antiviral drugs and PDCoV vaccines.

猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）感染引起的仔猪腹泻给养猪业带来巨大经济损失。PDCoV的病原学研究尚未深入开展,其复制机理未被阐明。本项目通过预研已证实PDCoV感染LLC-PK1细胞能诱导自噬。基于此结果，本项目将对PDCoV复制与宿主靶细胞自噬相互作用机制展开研究。本项目拟构建PDCoV体外感染系统，通过调控细胞自噬，明确其与PDCoV复制之间的关系；通过免疫共沉淀与激光共聚焦方法，鉴定诱导细胞自噬的PDCoV病毒蛋白并明确其作用域。本项目的研究结果有助于揭示细胞自噬与PDCoV复制的互作机制，为新型抗病毒药物的研制与PDCoV相关疫苗的研发提供科学依据和理论基础。

猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)是近年来新发现的是一类人畜共患病毒，其感染宿主范围十分广泛，包括鸟类、人以及其他哺乳动物，但到目前为止，其病原学研究相对较少。在本项目资助下，项目团队在细胞模型上对PDCoV感染细胞过程以及宿主反应机制进行了系统性研究，发现PDCoV在细胞上复制一代需要5-6 h，且胰蛋白酶对病毒在细胞上复制起到重要作用。胰蛋白酶能通过增强细胞的膜融合促进PDCoV在LLC-PK1细胞中的复制，但不能促进PDCoV入侵和释放。PDCoV复制能够引起细胞内的膜重排(membrane rearrangements)，形成双层膜囊泡(double-membrane vesicles，DMVs)、拉链状内质网(zippered endoplasmic reticulum)以及小泡状(small vesicles)结构等，但未形成甲型和丙型冠状病毒感染形成的复杂膜结构(convoluted membranes, CM)和小球体(spherules)等结构。除此之外，PDCoV感染细胞能形成大量自噬体结构，且自噬标志蛋白（LC3和p62）在感染后18-24 h显著提高，证明PDCoV感染能诱导细胞自噬。进一步筛选诱导自噬的病毒蛋白时发现，过表达非结构蛋白NSP7，辅助蛋白(accessory protein)NS6以及结构蛋白M, N, E等能够诱导自噬标志蛋白LC3II表达上升，且LC3蛋白能与NS6, N, E等蛋白相互作用，初步确定上述病毒蛋白参与诱导细胞自噬。对NS6蛋白进一步研究发现NS6能够在纯化病毒粒子中检测到，且NS6蛋白和结构蛋白(M, N)存在互作，证明NS6能够组装到病毒粒子中，但NS6抗体不能中和病毒。此项目的开展有助于全面了解PDCoV的入侵机制，为研究其致病性和研发抗病毒药物奠定了基础。