大额牛瘤胃细菌宏基因组BAC文库的构建及高活性纤维素酶基因的克隆与表达

大额牛为中国唯一的半野生半家养的珍稀牛种资源，主食竹子等高纤维植物仍能获得良好生长和增重。本项目采集自然条件下大额牛的瘤胃内容物，提取细菌宏基因组DNA，用CopyControl pCC1BAC 为载体构建细菌宏基因组BAC文库；对文库进行筛选获得表达纤维素酶活性的克隆，挑选活性强的克隆进行亚克隆和测序，构建纤维素酶基因系统进化树，预期发现新的纤维分解菌；用DNAman等基因分析软件分析纤维素酶基因结构，预测高活性位点；在E.coli表达系统中表达克隆到的基因，并检测表达产物的酶学特性。预期揭示大额牛高效利用纤维性饲料和采食竹子的瘤胃微生物基础，筛选高效分解粗纤维的基因和酶，结果可为反刍动物饲料高效转化和生物能源的利用提供一条有效途径，对大额牛的人工饲养及生物资源的开发具有重要的意义。

为研究大额牛高效利用竹子等粗纤维性饲料的瘤胃细菌纤维素酶基因功能，本项目采集自然条件下大额牛的瘤胃内容物，提取细菌宏基因组DNA，构建细菌宏基因组Fosmid文库。文库共获得34800个克隆，插入片段平均大小为36kb（23-48kb），文库外源DNA总容量为1382 Mb；文库克隆能稳定传代；对文库克隆进行部分酶活力筛选获得具有表达纤维素酶活性的克隆95个，木聚糖酶活性的克隆52个，淀粉酶活性的克隆116个以及同时具有纤维素酶活性和木聚糖酶活性的克隆23个；挑选复筛后活性强的6个纤维素酶活性克隆进行亚克隆和测序，测序结果表明有一个全长为942 bp的ORF，编码313个氨基酸的新基因H8CMC； H8CMC等电点4.86，预测分子量为36030.71Da，其编码的氨基酸序列显示第16-283个氨基酸是糖苷水解酶家族5功能域；H8CMC基因编码产物与乙酸杆菌属(Acetobacterium woodii DSM 1030 )纤维素酶CelA基因编码产物（YP_005268559.1）覆盖率达99%，同源性达45%；系统进化分析显示H8CMC与其他细菌种类在进化距离上相距较远，相似程度不高；H8CMC基因有可能自属于一个新的属种。通过H8CMC/ pGEX-6P-1/ 重组表达体系的构建、IPTG诱导重组克隆的表达，结果表明H8CMC基因原核表达的蛋白能表达出纤维素酶活性，H8CMC酶的最适温度是45℃，最适pH是5.5。实验结果初步揭示了大额牛高效利用纤维性饲料和采食竹子的瘤胃微生物基础，并筛选出了纤维素酶新基因1个。. 通过实施本项目共发表文章6篇，其中SCI收录1篇，申请发明专利1项，培养硕士研究生2名，职称晋升3人，入选云南省中青年学术技术带头人后备人才1人，入选云南农大“百名”青年学术技术带头人2人。