新疆双峰驼瘤胃微生物宏基因组文库构建和纤维素酶系的研究

新疆双峰驼是新疆地区的重要畜种资源，双峰驼胃属复胃，但解剖学结构与牛、羊的复胃不同，骆驼对干物质、粗纤维、纤维素的消化能力显著高于其他反刍动物和非反刍动物，其瘤胃为一天然的纤维素降解生物反应器。但苛刻的纯培养条件限制了对瘤胃微生物的深入研究。本项目拟从新疆双峰驼瘤胃内容物直接提取总DNA,利用核糖体ITS1序列文库分析该瘤胃中厌氧真菌的群落组成；构建该瘤胃微生物宏基因组Fosmid文库，以活性筛选法筛选表达纤维素酶活性的克隆并鉴定其纤维素酶基因，对它们进行遗传进化分析。表达1-2个特异性基因并鉴定其产物的酶学特性。我国具有丰富的可再生纤维素资源，纤维素酶降解纤维素后产生的糖类可被用来发酵生产燃料酒精和其它有用材料，纤维素酶法降解纤维素是生物精炼的关键环节。本项目的实施为纤维素酶的生产和应用奠定基础，对以纤维素为原料生产燃料酒精和生物精炼具有重要意义。

新疆双峰驼是新疆地区的重要畜种资源，双峰驼胃属复胃，但解剖学结构与牛、羊的复胃不同，骆驼对干物质、粗纤维、纤维素的消化能力显著高于其他反刍动物和非反刍动物，其瘤胃为一天然的纤维素降解生物反应器，但苛刻的纯培养条件限制了对瘤胃微生物纤维素降解酶基因资源的发掘。我国具有丰富的可再生纤维素资源，纤维素酶降解纤维素后产生的糖类可被用来发酵生产燃料酒精和其它有用材料，纤维素酶法降解纤维素是生物精炼的关键环节。.项目的主要研究内容包括：新疆双峰驼瘤胃中厌氧真菌的群落组成；瘤胃微生物宏基因组Fosmid 文库的构建；纤维素酶活性酶的获得及酶学特性的研究。.本项目构建了厌氧真菌ITS1 文库并随机挑选210个克隆测序，共获得 155个OTUs 并提交序列至GenBank（登录号为JX944829-JX944983），解析了双峰驼瘤胃厌氧真菌的结构组成。利用RDP Naive Bayesian rRNA Classifier Version 2.10进行分类（置信度阈值90%，以Warcup Fungal ITS trainset 1为分类级别），42个OTUs划分于Neocallimastigomycota门，Neocallimastigomycetes纲，Neocallimastigales目，Neocallimastigaceae科，其中2个OTUs划分为Cyllamyces属， 40个OTUs为未分类的Neocallimastigaceae；其余112个OTUs为未分类真菌。构建的系统进化树也显示了双峰驼瘤胃厌氧真菌的独特分类地位。采用宏基因组技术构建了新疆双峰驼瘤胃微生物宏基因组的Fosmid文库，文库约含25万个克隆，包含外源DNA总容量为8400Mbp，文库具有很好的多样性。通过宏基因组测序分析共获得了包括GH45、GH5、GH26、GH6、GH10、GH12、GH11、GH8、GH9、GH7、GH61、GH48、GH44、CBM8、CBM46等15种纤维素酶相关家族的1180个候选基因，其中长度大于300个氨基酸的基因有618个。选取其中一个与现有基因相似度较低的属于GH45家族的纤维素降解酶XJCGH45蛋白。对其进行了原核表达及纯化，研究了相应的酶学性质。综合研究结果，新疆双峰驼瘤胃微生物具有极强的特异性，具有深入研究的意义。.