云南大额牛瘤胃中纤维素降解的微生物多样性及纤维素酶基因研究

大额牛为中国唯一的半野生半家养的珍稀牛种资源，主食竹子等高纤维植物仍能获得良好生长和增重。本项目利用尼龙袋富集大额牛瘤胃降解竹子的微生物并通过宏基因组测序(总数据产出不小于8Gb)，组装；与参考数据库（NCBI的NR、COG、KEGG、STRING、Swiss-Prot及CAZy数据库）Blastx比对,进行物种注释和基因功能分析；基于已报道的纤维素酶基因序列，比较克隆大额牛纤维素酶基因，以及结合组装拼接的纤维素酶基因序列，筛选大额牛纤维素酶基因SNP；进行SNP位点功能预测分析，找到纤维素酶高活性位点；在E.coli表达系统中表达纤维素酶基因，并检测表达产物酶的活性。预期筛选和发掘大额牛瘤胃内降解竹子等粗纤维饲料的优势纤维菌和特有纤维菌以及纤维素酶和基因，结果可为反刍动物饲料高效转化和生物能源的利用提供一条有效途径，对大额牛的人工饲养及生物资源的开发具有重要的意义。

为研究云南大额牛高效利用竹子等粗纤维性饲料的瘤胃微生物多样性及纤维素酶基因功能，本项目通过对大额牛瘤胃微生物宏基因组DNA测序(总数据产出＞8Gb )，分析、组装。随机选用了33,000,000个reads（占总数据量的40.18%），以及10,387,566个EGTs（占已分析数据EGTs的76.68%）与NCBI的NR数据库进行Blastx 比对，进行物种分类分析以及将EGTs与eggNOG，COG，KEGG，CAZY和String数据库进行Blastx 比对，进行功能注释。大额牛瘤胃微生物主要由细菌域、真核生物域、古生菌域及部分不能确定域归属的未知微生物构成；其中微生物主要分属于十个门，其中丰度最高的两个门是拟杆菌门和厚壁菌门，分别占总细菌的48%和42%。大额牛瘤胃中主要的纤维菌为黄化瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌。EGTs功能分析结果表明无论是按eggNOG分类、COG分类还是Kegg分类，与碳水化合物转运和代谢、氨基酸转运和代谢相关功能的EGTs数都较其他类别多。从CAZy 5 大分类来看，大额牛瘤胃微生物EGTs主要由葡萄糖苷水解酶和葡萄糖基转移酶组成。此外，本项目还获得了2个纤维素酶基因并在E.coli BL21中成功表达。CMC-1的ORF有1239 bp，编码413个AA，属于糖苷水解酶家族2；系统进化分析显示CMC-1与其他细菌种类在进化距离上相距较远，其有可能自属于一个新的属种。CMC-2的ORF有1434 bp，编码477个AA，属于糖苷水解酶家族3；系统进化分析显示CMC-2编码蛋白与其Prevotella bergensis（WP_007173698.1）编码的糖苷水解酶在进化距离上聚成一支，其有可能来自于糖苷水解酶家族的Prevotella bergensis。通过CMC-1/ pGEX-6P-1/ 和CMC-2/ pGEX-6P-1/重组表达体系的构建、IPTG诱导重组克隆的表达，结果表明CMC-1和CMC-2基因原核表达的蛋白能表达纤维素酶活性。实验结果初步揭示了大额牛高效利用纤维性饲料和采食竹子的瘤胃微生物基础，并克隆出了纤维素酶新基因2个。通过实施本项目共发表论文5篇（含SCI论文1篇），授权发明专利1项，实用新型专利2项，培养硕士研究生2名，职称晋升1人，入选云南农大“百名”青年学术技术带头人1人。