云南大额牛瘤胃纤维素酶基因/基因簇功能分析及定向进化研究

The gayal is a rare semi-wild bovine species distributed throughout china. They can graze grasses including bamboo as well as reeds and other plant species, and attain higher mature live weights than those of cattle maintained in similar environments. Based on the research of National Natural Science Foundation of China (Grant No.30960256),this project will take advantage of a metagenomic library of circa 348,00 fosmids which have been constructed from bacterial DNA isolated from gayal rumen. We will plan to screen 400 clones for cellulose hydrolysing activities and sequence. All reads will be assembled using SOAPdenovo, with specific parameter for metagenomics data.Taxonomic assignments of all reads will be made on the basis of BLASTx search of the NCBI-NR database. Function analysis of all cellulase genes will be made on the basis of BLASTx search of the NCBI-COG, KEGG, STRING, Swiss-prot and CAZY database. We will try to analysis new cellulase gene structure, to find functional active site, to express new gene in E.coli and detect cellulase biochemical characterisation. Furthermore, based on the results of cellulase biochemical characterisation, directed evolution techniquees of error-prone PCR and DNA shiffling will be used to improve the thermo stability or activity of cellulase. Results from this project will not only provide molecular basic data which ruminal microbe of gayal can more effectively degrade fibrous feed and bamboo, but also provide an effective way for conversion of ruminant feeds, artificial rearing of gayal and development and utilization of bioenergy.

大额牛在我国仅分布于云南，为半野生半家养的珍稀牛种资源，主食竹子，具有粗纤维消化能力强的特点。本项目利用已构建好的瘤胃细菌Fosmid文库（09年国家自然基金），拟筛选具有纤维素酶活性克隆400个，测序，组装；与参考数据库（NCBI的NR、COG、KEGG、STRING、Swiss-Prot及CAZy数据库）Blastx比对,进行物种注释和基因功能分析；用DNAman等基因分析软件分析新纤维素酶基因结构，预测高活性位点；在E.coli表达系统中表达新纤维素酶基因，检测表达产物的酶学性质并根据研究结果采用易错PCR/DNA改组技术对其进行定向改造，以进一步提高其稳定性和/或酶活力；预期揭示大额牛高效利用纤维性饲料和采食竹子的瘤胃微生物基础，筛选高效分解粗纤维的基因和酶，结果可为反刍动物饲料高效转化和生物能源的利用提供一条有效途径，对大额牛的人工饲养及生物资源的开发具有重要的意义。

为研究云南大额牛高效利用竹子等粗纤维性饲料的瘤胃微生物多样性及纤维素酶基因功能，本项目从大额牛瘤胃细菌Fosmid文库中筛选出504个具有纤维素酶活性的阳性克隆测序，组装；与参考数据库（NCBI的NR、COG、KEGG及CAZy）比对，进行物种注释和基因功能分析；同时对能高效表达纤维素酶活力的CMC-1酶进行改造，以进一步提高酶活力。结果表明：大额牛瘤胃微生物主要由细菌域、真核生物域、古生菌域构成，且含有大量未知菌；细菌中以Firmicutes和Bacteroidete为主；瘤胃中主要的纤维降解菌为Ruminococcus flavefaciens、Fibrobacter succinogenes 、Ruminococcus albus、Butyrivibrio fibrisolvens和Lachnospiraceae bacterium；COG和KEGG功能分析显示大额牛瘤胃基因功能主要是参与碳水化合物代谢及氨基酸代谢；CAZy活性酶分析表明糖苷水解酶GHs是瘤胃碳水化合物酶类中的主要酶，在GHs家族中与纤维降解有关且占比最多的分别为GH5、GH26、GH3、GH39等；大额牛瘤胃细菌降解纤维的酶以内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶为主；纤维素酶基因聚类分析显示瘤胃中有很多纤维素酶新基因或新的纤维菌；成功克隆并在E.coli BL21中表达出纤维素酶活性的CMC-1和CMC-2基因；CMC-1酶最适温度50 ℃，最适pH 5.0；此外，项目采用易错PCR对CMC-1酶进行改造，获得四个突变体；通过对四个突变体和CMC-1基因异源表达及酶学特性比较，发现有两个突变体的最适温度较CMC-1的50℃下降了5℃，有两个突变体的最适pH较之CMC-1的5.0升高到5.5，有三个突变体酶活力较CMC-1有1～2倍提高；综合最适温度、最适pH以及酶活，得到突变酶EP-15具有一定的开发价值。实验结果初步揭示了大额牛高效利用纤维性饲料和采食竹子的瘤胃微生物基础，并成功改造纤维素酶一个；结果可为反刍动物饲料高效转化和生物能源的利用提供一条有效途径。通过实施本项目，共发表论文4篇（含SCI论文1篇），授权专利5项。培养硕士研究生3名，1人获云南农大 “百名”青年学术技术带头人称号。