双特异性MAPK磷酸酶（MKPs）的结构与功能研究

The mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways mediate various physiological processes. Full activation of MAPKs requires phosphorylation on both threonine and tyrosine residues in the activation loop, and the MAPK pathways can be down regulate by various protein phosphatases. In mammalian cells, there are 10 distinct dual specificity MAP kinase phosphatases (MKPs), which dephosphorylate both phosphothreonine and phosphotyrosine residues in MAPKs. MKPs generally exhibit distinct substrate specificity toward three major classes of MAPKs (ERK, JNK and p38), and can be classified into three groups based on sequence similarity, substrate specificity and predominant subcellular localization. They can act as negative feedback regulators of MAPK activity, but also provide mechanisms of crosstalk between distinct MAPK pathways and between MAPK signaling and other intracellular signaling modules. Deregulation of MAPK signaling is the most common alteration in human cancers, and recent studies have suggested that MKPs play an important role not only in the development of cancers, but also in the response of cancer cells to chemotherapy. We will determine the three-dimensional structures of MKPs and their complexes with various substrates and regulators, and perform biochemical, biophysical, and computational analyses to figure out the roles of MKPs in the regulation of MAPK activities. Understanding the mechanisms by which individual MKPs recognize and interact with different MAPK isoforms can also be exploited to design inhibitors that specifically target MKPs.

丝裂原活化的蛋白激酶MAPK在多种细胞过程中发挥重要作用，其催化活性依赖于活化环上关键苏氨酸和酪氨酸的同时磷酸化。哺乳动物中有多种蛋白磷酸酶可以去磷酸化活化的MAPK，负调控MAPK活性；特别是10个双特异性MAPK磷酸酶MKP，能同时去磷酸化MAPK的苏氨酸和酪氨酸。根据结构域组成、底物特异性、亚细胞定位的不同，MKP又分为三类，对不同MAPK（ERK、JNK、p38）具有不同的识别模式和作用机制。MKP不仅是MAPK活性的负反馈调节器，还能提供不同MAPK通路之间以及MAPK与其他信号模块之间交互调节的节点。MAPK信号异常是人类癌症中最常见的变化，而MKP不仅与多种恶性肿瘤的发生发展有关，在癌细胞对化疗的响应方面也起着重要的作用。本项目将综合运用生物化学、分子生物学、结构生物学、生物信息学等方法，研究MKP识别、催化不同MAPK底物的分子机制，为相关药物的设计研发提供理论基础。

MKPs(MAPKs dual-specificity phosphatases)是MAPKs的双位点特异性磷酸酶，它可以去磷酸化MAPKs的两个磷酸化位点，从而使其失去活力。MKPs主要由负责底物识别的KBD结构域和负责催化的CD结构域组成。但是，不同MKPs如何特异性识别相应的底物MAPKs？底物的结合如何激活MKPs催化活性的分子机制还不清楚。本课题对MKP3与ERK2相互作用的模式和别构激活的分子机制，蛋白磷酸酶HePTP和调蛋白磷酸酶调节蛋白（RCANs）结构和功能研究，并对MKK6对p38α双重磷酸化进行了动力学分析，取得了多项重要进展。（1）分析了ERK2别构激活MKP3分子机制。构建了ERK2与MKP-CD复合物初始模型，并进行了长时间动力学模拟。发现MKP3催化域上从MAPK结合位点到催化中心的别构信号传导通路，并建立了别构激活的分子机制模型。（2）解析了MKP3-KBD及其与ERK2的复合物晶体结构，揭示了一种新的MKP3-KBD与ERK2结合的机制。这些研究对MAPK-MKP相互作用的分子基础有了新的认识，并为开发ERK2抑制剂提供了信息。（3）HePTP是ERK1/2和p38α激酶的负调控因子，使其底物活化环上的酪氨酸发生去磷酸化。我们发现HePTP可通过与p38α/pT结合，激活p38α/pT的催化活性，而对ERK2/pT没有激活作用。我们还解析了p38α与HePTP的KIM肽段（pepHePTPm）复合物结构，阐明了这种别构激活的分子机制。（4）钙调蛋白磷酸酶调节蛋白RCANs（Regulators of calcineurin）是一个内源性CN（calcineurin）抑制蛋白，它能够负反馈调节钙调蛋白磷酸酶的催化活性。我们研究了RCAN1对CN活性的调节机制，这为钙调蛋白磷酸酶和RCAN1之间的相互作用提供了新的见解。（5）p38α激酶是MAPKs家族的代表性成员之一，其活化环上的Thr和Tyr可以同时被上游激酶MKK6磷酸化，激活其激酶活力。我们对p38α上游激酶MKK6进行了动力学研究，并揭示了MKK6的催化反应机制。首次证明了在符合生理意义的模型和参数基础上，单层的MAPK磷酸化/去鳞酸化系统确实可以出现双稳态现象。综上所述，这些研究成果大大促进了人们对蛋白磷酸酶P识别、催化不同MAPK底物的分子机制的认识。