miR-122在脓毒症过程中促凝作用的实验研究

Researches have proved that miRNAs were involved in many processes of sepsis patients, and one research of ours has proved that levels of serum miR-122 were correlated with the short-term mortality of sepsis patient. In this research , we firstly proved that miR-122 correlated to the coagulation disorders of sepsis patients. Then, we will be focused on (1) Bioinformatics analysis to predict possible target genes of miR-122 involved in the procoagulant process; (2)To explore the mechanism of miR-122 effecting the coagulation pathway in vitro;(3)To explore how the expression changes of miR -122 can effect coagulation pathway and mortality of sepsis in vivo. Our research is in order to reveal the mechanism of miR-122 invovled in coagulation process of sepsis patients in vitro and in vivo and will provide novel treatment target for coagulation disorders of sepsis patients.

研究证实miRNAs参与脓毒症的多种生物学过程，其中我们一项研究证实血清miR-122含量同脓毒症患者短期病死率相关。在本课题中我们前期研究在临床样本中首次初步证实miR-122在脓毒症凝血障碍中具有促凝作用，接下来我们将(1)生物信息学分析miR-122预测靶基因在促凝过程中的可能靶点;(2)在细胞内探讨miR-122导致促凝作用可能靶点及对凝血通路的影响；(3)在动物水平证实miR-122水平变化对凝血通路组分及脓毒症动物模型病死率变化的影响。本课题将拟从细胞和动物水平揭示miR-122参与凝血过程的可能分子机制，为脓毒症过程凝血紊乱的治疗提供新靶点。

脓毒症是由于病原微生物入侵机体引起全身炎症反应。在脓毒症患者中，弥散性血管内凝血（DIC）发病率高达 25-50%。miRNA是一类非编码的小RNA分子，人体内许多生物过程均有miRNA的参与。miR-122是一种肝脏特异性的miRNA，表达量占肝脏所有miRNA70%以上，可作为肝脏损伤特异标记物，已有文章证实可将miR-122作为重度脓毒症血清学标记物。本研究小组前期研究发现miR-122在脓毒症凝血功能正常组与凝血功能异常组差异显著，推测miR-122通过影响直接或间接对凝血通路相关组分进行调控，从而影响凝血功能。本研究利用 miRanda 和 TargetScan 两个miRNA 靶基因数据库预测miR-122 的靶基因取并集，与脓毒症过程凝血紊乱相关的通路共同构建 Signal-Net，选取网络中参与脓毒症凝血过程的miR-122的直接靶基因及间接靶点，锁定A2M、MASP1/2 CD59、ATIII、F8及HO-1进行下一步研究。分别在参与脓毒症凝血障碍主要细胞单核细胞（THP-1细胞株）、血管内皮细胞（HUVEC细胞）以及肝细胞（L0-2细胞株）内进行验证，通过lip3000分别瞬时转染上述三个细胞株，其后通过PCR在基因水平，Western-Blot在蛋白水平分别验证上述靶基因，并在瞬时转染24h-48h后，利用LPS分别刺激THP-1和HUVEC及L0-2细胞，收集细胞及上清分别测定相应参与靶基因及编码蛋白表达含量，并测定其通路组分及培养基中各组分变化，最终发现miR-122的直接靶基因为MASP1，间接靶基因为H0-1，分别通过影响抑制补体功能及促进炎症因子表达，起到促凝作用。直接靶基因MASP1经双荧光素酶检测进一步确定为miR-122作用靶点。同时本研究入组脓毒症病例83例，5天内发生DIC共计34例，未发生DIC者49例，入组病例均24小时内留取血浆或血清，ELISA检测血浆MASP1与HO-1及补体C3、C4，发现脓毒症合并DIC组中HO-1、MASP1及补体C3、C4均较脓毒症不合并DIC组显著降低，临床研究与细胞实验结果结论一致。目前已有沉默ｍｉＲ －１２２ 表达的ｍｉＲＮＡｓ 靶向治疗丙型肝炎药物miravirsen进入临床实验阶段，此研究为此药物的临床应用开拓了新的领域。