枸杞MS2基因的克隆及其功能的初步研究

MS2 gene is necessary for anther development and sterility in plant. It was encode fatty acyl reductase, involved in the fat metabolize of anther tamptem. The anther tamptem and pollen wall development defectived in ms2 mutant.In this study, we intend to clone MS2 gene and study gene function in Lycium barbarum L. The study mainly include MS2 gene cloning and bioinformatics analysis, temoral and spatial expression characteristics for MS2 in anthers at different developmental stages by in situ hybridization. By methords of RNAi interference, phenotypic and cytological analysis the transgenic plants of wolfberry, we will understand the biological functions of MS2, and further transformation of MS2 gene in wolfberry to ms2 mutant in Arabidopsis, we will found the functional conservation of MS2 class in cotyledons plants.

MS2（Male sterily 2）类基因是植物花药发育过程中与育性相关的重要基因，该基因编码脂肪酰基还原酶，参与了花药绒毡层中脂类代谢过程。基因缺失后会影响到花药绒毡层和花粉壁的正常发育。本项目拟克隆枸杞中的MS2基因，并对该基因在枸杞花药发育过程中的功能做进一步研究。主要包括：克隆枸杞MS2基因，并对基因做相应的生物信息学分析；通过原位杂交和实时荧光定量PCR分析MS2基因在花药不同发育阶段的时空表达特征。通过RNAi干涉获得转基因枸杞植株，进而利用表型鉴定和细胞学分析等手段了解MS2基因的生物学功能；通过将枸杞MS2基因转化拟南芥ms2突变体并获得转基因植株，进而揭示MS2类基因在双子叶植物发育过程中的功能保守性。

项目研究背景及方向：枸杞是一种药食同源的经济作物，本项目针对理论和实践上有重要意义的枸杞花发育相关基因开展了研究。.研究内容及重要结果：.(一)、枸杞LbMS2基因的克隆及功能分析.1：克隆枸杞LbMS2基因，以宁夏枸杞(宁杞1号）为试验材料，采用RACE方法从枸杞花药cDNA中获得枸杞LbMS2基因。.2：生物信息学分析，对基因基本结构进行分析、进行功能预测、基因相似性和同源性分析、多序列比对分析并进一步绘制进化树、信号肽及亚细胞定位的预测。.3：半定量及定量PCR结果表明，LbMS2基因具有器官表达特异性，只在枸杞花器官中表达，并且在枸杞花药发育的四分体时期以及单核花粉时期表达量最高。.4：原位杂交结果证实了基因在花药绒毡层和小孢子中表达。亚细胞定位结果进一步验证LbMS2基因的叶绿体定位。.5：基因功能互补结果证实了枸杞LbMS2基因能够互补拟南芥ms2突变体的表型。.6：通过RNAi 技术，获得LbMS2 基因表达抑制的转基因植株，对转基因植株花药发育过程开展细胞学鉴定，结果证实转基因枸杞花药发育异常，未形成正常可育花粉。.(二)、枸杞LbMS2-2基因的克隆及功能分析.1：采用RACE方法克隆枸杞LbMS2基因的同源基因LbMS2-2基因，获得基因的ORF区段。.2：生物信息学分析表明，LbMS2-2蛋白定位于叶绿体中，该蛋白序列与茄科植物甜辣椒、烟草和马铃薯中的脂肪酰基还原酶表现出较高的序列相似性。.3：实时荧光定量PCR显示，LbMS2-2基因在枸杞花器官中表达，且在枸杞花药发育的四分体时期、单核花粉时期和双核花粉时期表达量较高。.4：原位杂交结果证实该基因只在花药绒毡层和小孢子中表达。亚细胞定位结果进一步验证LbMS2-2基因的叶绿体定位。.科学意义：此类脂肪酰基还原酶基因是枸杞花器官发育过程中的重要基因。