利用转录因子调控机制筛查小分子遗传代谢病的恒温扩增技术研究

Low screening rate of inherited metabolic diseases especially small molecule diseases restricts the improvement of Chinese new-born population quality. Sensitive and universal techniques of point-of-care testing for small metabolites are significant for large scale screening of small molecule diseases. Metabolite-responsive transcription factors (MRTF) are cellular small molecule sensors which have various responsive metabolites. In our last project, we found that tryptophan-responsive MRTF (TrpR) can repress rolling circle amplification in vitro, and this phenomenon was successfully used to detect tryptophan in a cell-independent way. In this project, we further present the concept of isothermal amplification regulated by MRTF (MRTF-IA), and apply it to the detection of three small metabolites by MRTF-IA. We will study the regulatory ability of various isothermal amplifications by different transcription factors, and use phenylalanine, galactose and homocysteine as three cases to prove the concept correctness, detecting university and detection effectiveness of MRTF-IA. This project will establish novel, sensitive and convenient techniques for analyzing important metabolites involved in inherited metabolic diseases, present new strategies for exploiting point-of-care testing products for more small molecular inherited metabolic diseases, and provide an effective technical support for screening inherited metabolic diseases in China.

遗传代谢病尤其是小分子病的低筛查率制约着我国出生人口素质的提高，灵敏、普适的小分子即时检验技术对小分子病筛查的普及具有重要意义。代谢物应答转录因子（MRTF）是具有众多效应物的细胞内小分子传感器，在前一个基金项目中，我们发现了色氨酸应答的MRTF（TrpR）对体外滚环扩增的阻遏现象，并成功地将其应用于非细胞依赖的色氨酸快速检测。在本项目中，我们进而提出MRTF调控恒温扩增系统（MRTF-IA）的概念以及利用MRTF-IA检测代谢小分子的三种普适情况。通过研究不同转录因子对多种恒温扩增的调控能力以及MRTF-IA在三种情况下对苯丙氨酸、半乳糖和同型半胱氨酸的检测，完成该系统的概念、普适性和小分子检测效果的验证。本研究将建立与遗传代谢病筛检相关的三种重要小分子的快速、灵敏检测新技术，为更多小分子病即时筛检产品的开发提供新思路和奠定研究基础，为提高我国遗传代谢病的筛查水平提供有效的技术支持。

代谢小分子检测对于遗传代谢病的诊断十分重要，目前尚缺乏便捷的筛查技术平台。在本项目中，我们提出利用转录因子对恒温扩增等调控的方案，开辟检测代谢小分子的新途径。我们以诱导型和阻遏型转录因子为模型，探讨其对不同恒温扩增、酶切、非酶促反应的调控效果。基于此成功地建立了系列的转录因子介导的代谢小分子的检测技术。.我们基于转录因子对RCA的调控，发现核酸序列对银染色的影响，将其首次用于RCA检测，实现了转录因子调控RCA的半乳糖肉眼可视化检测。我们也验证了转录因子对RPA的直接调控，基于此提出并建立了repressor-RPA技术，首次实现了RPA对半乳糖的检测，以及在生物样品中的检测。我们验证了转录因子对SDA的直接调控，提出并建立了repressor-SDA技术，首次实现了SDA对半乳糖的检测，以及在生物样品中的检测。我们还探讨了转录因子调控酶切保护策略，成功地实现了转录因子的酶切调控对半乳糖的检测，以及在实际样品中的检测。.我们发现阻遏型转录因子调控恒温扩增检测小分子常为信号关检测，为实现更理想的信号开检测，我们开发了转录因子调控分子信标变构的纳米开关传感器，巧妙偶联转录因子结合与分子信标变构，实现了阻遏型转录因子检测小分子的信号开新策略，并实现了生物样品中的氨基酸的检测。这为转录因子介导的代谢小分子检测提供了便捷的新技术途径。.为解决无直接别构转录因子的代谢小分子检测问题，扩展技术平台所能检测的小分子范围，我们发展了代谢酶偶联的小分子转变策略，成功地利用代谢酶偶联恒温扩增等技术，实现了对乳糖、蜜二糖等无直接别构转录因子的其他小分子模型的检测。.通过该项目我们验证并扩展了MRTF-IA的概念，实现了诱导型、阻遏型、无直接作用转录因子三种情况下，利用包括恒温扩增在内的反应平台乃至非酶反应体系，对糖类、氨基酸等多种代谢小分子的检测新技术平台的开发，以及在实际样品中的检测应用。我们尽可能克服项目执行期间新冠疫情等困难的影响，共发表SCI文章3篇，申请国家发明专利3项，获授权2项，培养研究生3人。.