硅藻DNA条码的法庭科学应用基础研究

Diatoms are one of the biological basis for the diagnosis of drowning. Currently, forensic examination of diatom is mainly focus on morphology and lacks the ability to identify small, rare diatoms and those who presents similar morphological features. DNA barcoding has been demonstrated to have a good species identification capabilities of organism including diatoms, and can make up the insufficiency of the morphological methods. But it presents the following problems: 1. the polymorphism among and between species within each barcoding gene has difference, only the combination of several barcodes can resolve the molecular taxonomy and species identification of the diatoms. 2. It is difficult to analyze the cox1 and ITS gene by using the current method which is based on the sequencing of large fragment.3. It is necessary to establish the forensic molecular taxonomical method of the diatoms by combining forensic science practice. In preliminary experiments we have performed pyrosequencing of the 18S rRNA V4 hypervariable region in three kinds of diatoms and obtained a 23-25 bases sequencing pattern of single diatoms and mixed sequencing patterns of multi diatoms. Mixed sequencing results can accurately reflect the mixed state of diatoms, and presents a regular change with different mixing ratio. The results indicate that the mixed pyrosequencing of the diatoms can be used for direct comparison between groups to determine the source of the diatom. The project will explore the feasibility of analyzing the molecular mapping of the diatoms by direct comparison of pyrosequencing pattern, and provide the molecular taxonomical solution to drowning site confirmation.

硅藻是诊断溺死的生物学依据之一。现行法医硅藻检验以形态学方法为主，对微小、稀有和形态特征类似硅藻的鉴别能力不足。DNA条码对包括硅藻在内的有机体具有良好的种属鉴定能力，可弥补形态学方法的不足，但存在以下问题：1.各条码基因的种属内、种属间的多态性存在差异，联合使用才能解决硅藻的分子分类和种属鉴定。2. 常用的基于大片段测序的方法对部分条码基因如cox1和ITS基因分析困难；3. 需结合法庭科学实践建立法医学硅藻分子分类方案。预实验中我们对三种硅藻的18S rRNA基因V4高变区进行了焦磷酸测序，获得了23-25个碱基的单硅藻测序及多硅藻混合测序图谱。混合测序结果能准确反映硅藻的混合状态，并随混合比不同呈现规律性变化。提示混合硅藻的焦磷酸测序可用于硅藻群间的直接对比，以判断硅藻群来源。本项目将探索焦磷酸测序图谱直接对比法分析硅藻分子图谱的可行性，为解决溺死地确认等问题提供分子分类学解决方案。

现行法医硅藻检验以形态学方法为主，对微小、稀有和形态特征类似硅藻的鉴别能力不足。DNA条码对包括硅藻在内的有机体具有良好的种属鉴定能力，可弥补形态学方法的不足，但存在以下问题：1.各条码基因的种属内、种属间的多态性存在差异，联合使用才能解决硅藻的分子分类和种属鉴定。2. 常用的基于大片段测序的方法对部分条码基因如cox1和ITS基因分析困难；3. 需结合法庭科学实践建立法医学硅藻分子分类方案。本科题针对上述问题，提出利用DNA条码基因高变区的焦磷酸测序图谱解析进行混合硅藻群落的一致性分析，为法医学溺亡地推断和鉴别提供新方法。课题主要研究内容包括：1. 选择适用的DNA barcode基因，通过序列分析，明确条码基因高变区、相对保守序列信息，并设计相应的高变区扩增引物和焦磷酸测序引物。2. 建立单硅藻 DNA 条码基因的焦磷酸测序体系，并研究该体系应用于硅藻种属鉴定的系统效能。3. 建立混合硅藻 DNA 条码的焦磷酸检测体系，评估混合焦磷酸测序图直接对比法区分不同硅藻混合体系的能力。4. 初步建立适用于混合焦磷酸测序图谱直接对比法的统计学方法。5. 运用溺死动物模型，验证上述方法在法庭科学实践中的应用能力。经过四年的研究，本项目获得了以下研究结果：1. 选择了18s rDNA和rbcL基因作为硅藻DNA条码并构建了相应的焦磷酸测序体系；2. 运用已知硅藻混合而成的硅藻群落和AdvISER-M-PRYO软件建立了混合硅藻DNA焦磷酸图谱解析方法，并实现了水体的一致性分析。3. 运用溺死动物模型，验证了上述体系在法医学溺亡地（水源地）鉴定中的应用价值，并建立了相应的微生物群落分离方法、DNA提取方法、PCR扩增方法以及焦磷酸测序体系。上述结果共发表两篇论文（Int J Legal Med. 2018, 132:1611-20; Int J Legal Med. 2019, 133:1351-60），并获授权专利一项授权公开号：CN108265121B，授权公布日：2019.09.03）。本研究成果为本课题组原创性成果，其特点在于：1.摆脱了对数据库的依赖，不需要对水体/溺液中的每一种硅藻进行种属鉴定即可实现肺组织中硅藻群的来源水体推断；2.方法简便，灵敏度高，易于推广。