基于基因组/转录组技术的微量生物检材法医遗传学研究

The amount of nucleic acid in trace biological samples is lower than the minimum limitation of current detection techniques. Potential nucleic acid degradation is also expected in such samples. Current forensic testing methods and research of trace bio-samples show the following deficiencies: (1) the influence of stochastic effects is exaggerated in all current STRs and SNPs detection system. (2) Analyzing trace DNA mixture is difficult, so is identifying pollutions. (3) There is a lacking in effective identification system of tissue and organ sources. (4) It is difficult to gain the necessary amount of genetic information to meet the requirements of personal identification and parentage identification.. .To solve the problems above, the following ideas are put forward in this study: Based on the large-scale parallel sequencing, we will combine the whole genome /whole transcriptome amplification of single cell and DNA/RNA co-analysis of genetic markers in order to maximize the amount of genetic information of trace bio-samples. ..In this project, the following topics will be studied: (1) improving the detection sensitivity and veracity of trace samples through the mechanism study of stochastic effects and pseudo products. (2) The efficiency of physical haplotype consisting of closely linked genetic markers on the trace mixture analysis. (3) Utilizing the high throughput of the massively parallel sequencing, to implement the synchronous detection of DNA/RNA genetic markers and microbial DNA barcode; (4) Studying the cause of uncertainty exists in the genotying results, and providing evidence in light of massively parallel sequencing results explanations. The research results will improve the analyzing abilities of trace biological samples and provide novel insight on forensic practice.

法医学微量生物检材核酸含量低于现有分析方法的最低有效检测限，且多存在核酸降解。在检测和研究中存在以下问题：1.缺乏对扩增随机效应的机制研究；2.缺乏微量混合斑和污染的有效分析手段；3.缺乏组织来源的有效识别体系。4.难以获取个人识别和亲子鉴定所需的最低遗传信息量。为解决上述问题，本课题提出以下设想：以大规模平行测序为基础，结合WGA/WTA及DNA/RNA遗传标记的共检测，实现微量检材所含遗传信息的最大化获取。本课题将研究：1.随机效应产生机制，结合全基因组/全转录组扩增，提高微量检材检测灵敏度和准确度；2.连锁遗传标记的物理微单倍型对微量混合斑分析的作用；3.利用大规模平行测序平台的高通量，实现DNA/RNA遗传标记、微生物DNA条码的同步检测；4.对导致结果不确定性的原因进行研究，为大规模平行测序的结果解释提供数据支持。研究结果将提高微量生物检材的分析效能，为法医学实践提供新的策略。

DNA证据已经成为当今最重要的法庭科学证据之一，但也不乏质疑。究其原因，是法医生物检材存在的不确定性。据公安部门统计：疑难检材占比高达总检材量的62.7%，其中，涉及微量DNA分析的检材量呈逐年上升趋势。由于PCR时DNA模板量过低，微量DNA分析时会随机出现影子条带（Stutter）、等位基因丢失（drop-out）、等位基因插入（drop-in）、以及DNA污染等现象，被称为“随机效应”。随机效应会导致DNA图谱解析困难，严重影响法医DNA分析效能和证据效能。本项目的整体思路是，以分析技术创新为基础，寻求改善或消除随机效应的新型遗传标记或技术方法，综合提取微量生物检材所蕴含的各种生物信息，结合DNA分析数据解释方法的创新，最终实现微量生物检材证据效能的提升。本项目以新型遗传标记和分析方法研究为基础，重点研究随机效应的改善和消除方法。结合全转录组扩增和全基因组扩增方法，探索微量DNA、微量RNA的分析新技术。本项目获得了以下研究成果：1. 运用PCDR、MDA、微乳滴PCR等方法，实现了随机效应的改善。2. 运用PCDR、MDA、SMART-Seq等方法，提高了微量DNA、微量RNA的分析效能。其中，我们所构建的PCDR-STR-CE分析体系在满足个体识别效能的前提下，实现了对低至12.5pg的微量DNA有效分析。所构建的SMART-Seq2-mRNA分析体系可以实现对单枚指纹样本和保存达12年的血痕样本的体液来源识别。3. 运用单引物延伸和UMI条码，构建了由180个MH位点构成的NGS平台分析体系，可以满足降解、大比例混合DNA，以及低至100pg的微量DNA的分析需求。本项目实施共发表论文17篇，获授权专利4项。培养硕士研究生11名。项目部分研究成果和所建立的分析体系已经在刑事案件侦查中发挥作用。