Tat-NTS通过ANXA1触发p62/SQSTM1引起小胶质细胞IKK选择性自噬在缺血脑损伤中的保护作用机制研究

We have confirmed that ANXA1 distributing cytoplasm or nucleus has a very different effect on the expression of inflammatory factors in microglia, for which we synthesized the peptide Tat-NTS that inhibit ANXA1 nuclear translocation. Tat-NTS caused cytoplasmic ANXA1 increased, ANXA1 and IKK binding and cause IKK autophagic degradation. ANXA1 activates the autophagy system and causes IKK degradation to arouse our interest. Combined with the literature, we speculate that ANXA1 was modificated and combined with autophagic receptors in the mediation IKK autophagy. In this study, ANXA1-/- and Ubc-/- mice were used. First, we confirmed that Tat-NTS induced ANXA1 cytoplasmic aggregation to guide microglia cells from neuronal damage phenotype to neuronal protection phenotype. Than, by analyzing the SUMO modification of ANXA1, we demonstrate that ANXA1 of SUMO-modified binds to the UBA domain of autophagy receptor protein p62 to form IKK-ANXA1-p62 complex. p62 binds to LC3 through LIR domain to guide the complex into classical selective autophagy. Ultimately, we will find the molecular mechanism of Tat-NTS on neuroprotection by guiding microglia phenotype change.

我们前期研究已经确认ANXA1分布在小胶质细胞的胞浆和胞核对炎性因子表达产生截然不同的影响，为此我们合成了抑制ANXA1核转位的肽段Tat-NTS。Tat-NTS引起胞浆ANXA1增加，ANXA1与IKK结合并引起IKK自噬降解。ANXA1激活自噬系统并引起IKK降解的途径引起我们的兴趣。结合文献，我们推测ANXA1通过分子修饰与自噬受体结合介导IKK自噬。本项目拟利用ANXA1-/-和Ubc-/-小鼠，以Tat-NTS引起ANXA1胞浆聚集引导小胶质细胞从神经元损伤型转化为神经元保护型为切入点；通过分析ANXA1的SUMO化修饰，确认SUMO化修饰的ANXA1与自噬受体蛋白p62的UBA结构域结合，形成IKK-ANXA1-p62复合物，p62通过LIR结构域与LC3结合，引导复合体进入经典选择性自噬，最终阐明Tat-NTS对小胶质细胞表型的调节作用及神经保护的分子机制。

在前期确认ANXA1分布在小胶质细胞的胞浆和胞核对炎性因子表达产生截然不同的影响，并合成抑制ANXA1核转位的肽段Tat-NTS基础上，发现利用Tat-NTS能引起胞浆ANXA1与IKK结合并引起IKK自噬降解，使小胶质细胞从促炎表型（M1型）转化为抗炎表型（M2型）。本研究以Tat-NTS引起ANXA1胞浆聚集引导小胶质细胞从神经元损伤型转化为神经元保护型为切入点；通过分析ANXA1的SUMO化修饰，确认SUMO化修饰的ANXA1与自噬受体蛋白的UBA结构域结合，形成IKK-ANXA1-自噬受体蛋白复合物，通过LIR结构域与LC3结合，引导复合体进入经典选择性自噬，最终阐明Tat-NTS对小胶质细胞表型的调节作用及神经保护的分子机制。结果显示：（1）苏木化修饰ANXA1促进脑缺血后小胶质细胞由促炎M1型向抗炎M2型极化；（2）苏木化修饰ANXA1特异性抑制脑缺血后NF-kB信号通路的激活，而对MAPK信号通路没有明显的影响；（3）苏木化修饰ANXA1通过靶向IKK复合物催化亚基IKKa调控NF-kB信号通路的活性；（4）苏木化修饰ANXA1促进IKKa蛋白的降解，而对其mRNA没有明显作用；（5）苏木化修饰ANXA1通过自噬溶酶体途径介导IKKa蛋白的降解；（6）苏木化修饰ANXA1桥接IKKa与自噬受体NBR1的相互作用介导其选择性自噬降解；（7）在体上调小胶质细胞ANXA1苏木化水平减弱脑缺血再灌注损伤所引发的神经功能缺损；（8）Tat-NTS引起OGD/R处理的小胶质细胞表型从促炎性因子高表达的M1型转化为抗炎性因子高表达的M2型；（9）Tat-NTS增强OGD/R小胶质细胞胞浆内ANXA1的SUMO化修饰：（10）Tat-NTS通过ANXA1SUMO化修饰抑制小胶质细胞NF-κB信号通路，其抑制作用与细胞自噬相关；（11）Tat-NTS促进小胶质细胞ANXA1SUMO化修饰对神经元具有保护作用；（12）Tat-NTS对MCAO/R小鼠学习记忆受损具有翻转作用，这种效应表现为ANXA1苏木化修饰依赖。本研究以小胶质细胞ANXA1介导IKK 选择性自噬为切入点，逐步探讨Tat-NTS促进ANXA1胞浆聚集后，ANXA1发生苏木化修饰并介导IKK自噬的分子机制.