缺血脑损伤中TRPM7/ChaK1介导神经元Annexin 1膜转位及分泌在小胶质细胞活化中的作用

研究发现TRPM7/ChaK1具有离子通道和蛋白激酶双功能。缺血神经元中TRPM7离子通道功能激活导致细胞Ca2+超载是神经元死亡的重要机制，但其ChaK1激酶功能在缺血脑损伤中的作用未见报道。 结合本课题组前期研究及预实验，我们猜测在缺血神经元中TRPM7/Chak1可能通过磷酸化其下游重要底物Annexin 1，介导其膜转位及分泌，进而经Annexin1-FPR途径趋化并激活保护性M2型小胶质细胞。本研究拟在确认TRPM7激酶磷酸化Annexin 1并驱动Annexin 1膜转位和分泌的基础上；研究Annexin 1是否通过FPR途径介导小胶质细胞向神经元趋化；并提出神经元分泌的Annexin 1是小胶质细胞活化为M2型的内源性关键分子；通过Annexin 1-FPR途径活化的M2型小胶质细胞具有神经元保护作用。本项目将发现神经元保护的内源性关键分子及作用机制，寻找治疗新靶点。

研究发现TRPM7/ChaK1具有离子通道和蛋白激酶双功能。缺血神经元中TRPM7离子通道功能激活导致细胞Ca2+超载是神经元死亡的重要机制，但其ChaK1激酶功能在缺血脑损伤中的作用未见报道。结合本课题组前期研究，我们猜测缺血神经元TRPM7/Chak1可能通过磷酸化其下游重要底物Annexin1（ANXA1），介导其膜转位及分泌，进而经ANXA1-FPR途径趋化并激活保护性M2型小胶质细胞。本研究拟在确认TRPM7激酶磷酸化ANXA1并驱动ANXA1膜转位和分泌的基础上；研究ANXA1是否通过FPR途径介导小胶质细胞向神经元趋化；并提出ANXA1是小胶质细胞活化为M2型的内源性关键分子；通过ANXA1-FPR途径活化的M2型小胶质细胞具有神经元保护作用。本研究发现：1）TRPM7与ANXA1共存与同一细胞，免疫共沉淀显示OGD/R诱导ANXA1与TRPM7结合，随着复氧时间延长其结合量呈比例增加，BAPTA-AM或EDTA螯合细胞内外钙离子不影响ANXA1与TRPM7结合。截断TRPM7激酶区（TRPM7/△Kin），ANXA1与TRPM7结合能力消失。由此可见TRPM7通过其激酶区、以钙非依赖性方式与ANXA1结合。2）OGD/R能诱导ANXA1膜转位及核转位，截断TRPM7激酶区或转入ANXA1S5A（突变ANXA1抑制TRPM7对其磷酸化），OGD/R诱导ANXA1膜转位及核转位被逆转；而ANXA1 S5D（模拟TRPM7对其磷酸化）促进ANXA1核转位。结果提示OGD/R诱导TRPM7激酶磷酸化ANXA1并引起其膜核转位。3）OGD/R处理海马脑片能诱导海马神经元高表达ANXA1，并诱导小胶质细胞高表达ANXA1受体FPR，同时，海马CA1区小胶质细胞活化明显增加；ANXA1模拟肽Ac2-26能显著增加海马脑片Iba1阳性细胞数量，而FPRs拮抗剂Boc1显著减少海马脑片CA1区Iba1阳性细胞数量；膜片钳实验显示：AC2-26处理BV-2小胶质细胞，全细胞电流受明显影响细胞占所记录细胞总数的60%。上述结果提示： ANXA1经由FPRs途径参与了OGD/R引起的小胶质细胞活化过程。4）小胶质细胞具有经典激活的促炎型(M1)和选择性激活的抗炎型(M2)双重属性。我们研究发现：Ac2-26孵育BV-2细胞能明显上调arginase-1(M2标志物)表达，并