G蛋白偶联受体在模拟生物膜上的二聚化机理研究

G蛋白偶联受体（GPCR）在生物膜上是以何种形式存在，以及该存在形式与信号传导功能之间的关系，是GPCR结构与功能研究领域急需解决的关键问题。现有研究已证明C族GPCR在细胞膜上是以稳定的二聚化形式存在并发挥功能，而对于A族GPCR是否普遍存在二聚化现象，以及二聚化形式与信号传导功能之间的关系尚存在巨大争议。.本项目拟以两种典型A族GPCR：牛视紫红质和趋化因子受体CCR3为研究对象，利用荧光共振能量转移技术对A族GPCR在模拟生物膜上的二聚化现象进行检测，同时测定二聚化过程的动力学和热力学参数，从而为A族GPCR二聚化这一重要科学问题提供直接证据及更全面信息；并通过考察不同磷脂生物膜、配基分子等对A族GPCR二聚化过程的影响，以及二聚化与信号传导功能之间的关系，揭示A族GPCR二聚化作用机理及意义。本研究将为更清楚理解GPCR跨膜信号传导机理以及相关药物设计奠定重要的理论基础。

本项目以趋化因子受体CCR3为研究对象，分别利用哺乳动物细胞和大肠杆菌两种表达体系建立了过量表达CCR3受体的方法，并证明了哺乳动物细胞表达的CCR3与大肠杆菌表达的MBP-CCR3融合蛋白均具有结合其内源性配基的生物活性，实现了CCR3受体蛋白的过量活性表达，获得了克级以上足量的高质量活性蛋白。同时，本课题还发展了两种人趋化因子CCL11和CCL24在大肠杆菌体内活性、可溶性、过量表达的新方法，并首次对趋化因子在变性剂中的稳定性和去折叠过程进行了表征。在此基础上，通过体外荧光标记，并利用荧光共振能量转移技术对CCR3在模拟生物膜上的二聚化现象进行了检测，首次证明人CCR3在体外模拟生物膜中存在二聚化现象，这为“A族GPCR是否存在二聚化”的争议，提供了直接的试验证据；同时本课题还对CCR3二聚化的动力学参数进行了测定，这为CCR3二聚化过程提供了更详尽的信息，也为更好地理解CCR3结构与功能提供了重要参考。