G蛋白偶联受体激活过程中的构象变化及其中间态构象的单分子研究

G protein coupled receptors participate in a wide range of cellular processes and are thus important drug targets. The activation process of GPCR has been traditionally described as following the two-state model. Recently, significant progress has been made to demonstrate that the activation of GPCR is not a mere shift of the equilibrium between the two states.There exists several intermediate conformations which can be induced by different biased ligands. These intermediate states correspond to different downstream signal pathways. However, the mechanism of the transition of GPCR from a silent inactive state to an active state through several intermediate conformations remains still unclear. To address this issue, agonist-induced conformational dynamics and intermediate conformations of β2AR will be investigated systematically using optimized single molecular fluorescence resonance energy transfer, which will provide detailed insight into the dynamic process of biased agonist-induced β2AR activation. The equilibrium constant and kinetics will be also determined to provide detailed information on the dynamic process of β2AR activation. This research will provide fundamental knowledge for better understanding of the mechanism of GPCR activation and design of safe and effective drugs.

长期以来，GPCR的激活过程被认为是"两态模型"。近年来研究发现，同一受体在不同结构与功能激动剂作用下，并不是简单的活性与非活性状态之间的平衡移动，而是存在多种不同的中间态构象,且不同中间态构象可以对应激活不同的下游信号通路。目前对于GPCR如何从非活性状态经过一系列中间态构象变化，转变为活性状态的作用机制尚不清楚。 本项目拟以肾上腺素受体β2AR为研究对象，利用单分子荧光共振能量转移(FRET)技术对不同激动剂作用下β2AR受体分子内构象的变化及其中间态构象进行检测。通过建立最优的受体分子内构象的FRET检测方法，测定不同激动剂作用下β2AR分子内构象变化大小及其动力学参数，为β2AR激活的动态过程提供全面信息；同时通过对不同激动剂作用下β2AR中间态构象的表征，阐明不同激动剂对β2AR选择性激活的调控机制，从而为全面了解GPCR激活的动态过程及更安全高效的药物设计奠定理论基础。

G蛋白偶联受体（GPCR）是一类具有七次跨膜螺旋结构的膜蛋白受体，其介导了细胞内诸多跨膜信号转导过程，是重要的药物靶点。然而，目前对于GPCR在不同激动剂刺激下，如何从静息状态转变为活性状态的分子机制尚不清楚。本项目以三种典型A族GPCR为研究对象，通过建立异源稳转体系，实现了三种GPCR在HEK293细胞膜上的稳定活性表达。在此基础上，首次采用单分子荧光成像技术对CXCR4、CCR3和β2-AR等三种GPCR分子在细胞膜上的聚集状态进行了系统表征，从实验角度验证了三种GPCR分子在细胞膜上主要以单体形式存在，其聚集状态受到表达丰度的显著影响。激动剂结合可以有效调控GPCR在细胞膜上的聚集状态，且完全激动剂、部分激动剂和反向激动剂等不同结构与功能激动剂调控效果具有明显差异。通过RNAi沉默β-arrestin基因表达或百日咳毒素处理使G蛋白异三聚体解偶联，研究了GPCR聚集与下游信号通路以及运动之间的关系，结果表明GPCR聚集与下游信号通路的选择性激活以及在细胞膜上的运动具有密切的关系。同时，本项目通过系统优化CXCR4定点标记位点，标记染料/荧光蛋白类型以及激动剂作用浓度等条件，建立了最优的检测CXCR4分子内构象变化的FRET条件，并分别选择完全激动剂、部分激动剂和反向激动剂对CXCR4的分子内构象变化的宏观FRET进行了表征。结果发现，不同激动剂作用下CXCR4分子内构象变化是有显著差异的。这些构象变化的差异可能直接导致激活下游信号通路的差异，进而产生不同的生物学功能。此外，本项目还系统对比研究了CCL5，CCL8，CCL11和CCL24等四种趋化因子与CCR3的相互作用过程，从而为更好地解释CCR3的选择性激活机制奠定基础。本项目首次提出了不同偏好性激动剂作用下GPCR选择性激活的动态变化模型，为全面揭示GPCR选择性激活过程的分子机制，以及GPCR相关的疾病治疗和更安全高效的药物设计奠定了重要的工作基础。