汉方己甲素通过上调FOXO3a因子拮抗CBA/Ca小鼠噪音性聋的机制研究

Oxidative stress is an important mechanism of noise-induced hearing loss (NIHL), and Ca2+ overload may be its initiating signal. As one kind of calcium channels to maintain Ca2+ homeostasis, T-Ca2+ channels may also play an important role in regulating factors involved in oxidative stress, such as FOXO3a, which is one of the downstream factors in oxidative stress related pathways. In the preliminary study , We have found that Tetrandrine(TET) has an otoprotective effect against NIHL on CBA/CaJ mice. Besides, we found it could block T-Ca2+ channels on spiral ganglions. Thereby, we speculate that TET may reduce the generation of ROS by blocking T-Ca2+ channels, regulating the activation of CaN, AKT, AMPK and FOXO3a in the process of otoprotective effects. Based on this hypothesis, we will establish NIHL models on CBA/Ca mice and FOXO3a silenced CBA/Ca mice by injecting siRNA through round window. And we will use functional hearing test, morphology and molecular research methods to explore whether TET inhibits oxidative stress in NIHL relying on FOXO3a expression. So clarifying its mechanism against NIHL will supply an experiment evidence for the medicine from laboratory bench to bedside.

氧化应激是噪音性聋的重要发生机制，Ca2+超载可能是噪音引起氧化应激反应的启动信号，而T-Ca2+通道可以维持细胞Ca2+稳态，还能参与调控氧化应激相关因子活性如FOXO3a，FOXO3a则是细胞氧化应激相关通路的下游因子之一。我们前期研究发现汉方己甲素(TET)能够保护噪音性聋，并且该药物能通过T-Ca2+通道降低Ca2+流，因此我们推测在拮抗噪音性聋的过程中，TET可能通过阻断T-Ca2+通道减少Ca2+内流，导致相关因子的活性抑制或激活，进一步激活并上调转录因子FOXO3a，减少ROS的产生。基于该假说我们建立了噪音性聋小鼠模型和运用RNA干扰技术将siRAN导入耳蜗沉默同源小鼠FOXO3a基因表达后的噪音性聋模型，通过听力学、形态学、分子学等手段探讨TET是否通过阻断T-Ca2+通道调控相关因子，并依赖FOXO3a的表达达到拮抗噪音性聋的作用，为临床噪音性聋的药物治疗提供实验依据。

感音神经性聋是临床常见疾病，其常见诱因包括噪音暴露、药物性、年龄相关性，目前尚无有效的预防或治疗药物。我们前期研究中发现提前给予中草药提取物汉防己甲素（Tetrandrine,TET)对噪音暴露引起的小鼠感音神经性聋有拮抗作用，该药物已在临床用于肿瘤、风湿等疾病，因此我们推测其可能能够拮抗氨基糖苷类诱导的感音神经性聋。在建立噪音性聋模型的同时建立了稳定的新霉素致药物性聋小鼠模型，通过在体内、体外建立培养模型，进一步探究TET对新霉素诱导耳聋的拮抗作用及其在调节氧化应激途径的潜在机制。实验首先在HEI-OC1细胞系中建立新霉素损伤模型，用CCK-8、细胞计数等方法探讨TET能否提高新霉素损伤后的毛细胞存活率，并寻找最佳作用浓度。在HEI-OC1细胞系及小鼠耳蜗基底膜外植体毛细胞损伤模型中，通过免疫荧光技术、流式细胞技术检测TET对新霉素损伤后的活性氧、细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。建立动物新霉素耳聋损伤和药物保护模型，利用ABR评估听力水平，并通过免疫荧光染色和计数检测毛细胞的损伤情况；最后运用RNA-seq技术探究TET改善新霉素所致听力下降的机制和作用通路，通过qPCR技术验证相关通路基因差异进一步确定通路相关性。在体外试验中，HEI-OC1细胞系在新霉素损伤后，一定浓度范围内的TET可以提高细胞的存活率。1uM的TET可以降低细胞的凋亡、减少细胞活性氧的累积；在基底膜组织体外培养损伤模型中，1uM的TET可以减少毛细胞的损伤，降低毛细胞凋亡率，同时减少氧化应激的发生；在动物体内损伤模型中，TET可以降低新霉素损伤后小鼠的听阈，减少毛细胞的凋亡，降低凋亡蛋白的表达。RNA-seq分析结果显示TET能够通过调节钙信号通路及类固醇的生物合成，并利用q-PCR分析出7个相关基因。总之，TET不仅能够拮抗急性噪音性聋，也能够拮抗新霉素诱导的药物性聋，后续我们将继续深入探索类固醇生物合成途径相关基因在TET拮抗氧化应激所致毛细胞损伤中的变化,为临床开发噪音或药物所致的感音性聋的预防和治疗药物提供新的希望，本项目具有很好的应用前景。