利用高通量测序技术检测新生RNA二级结构及检验其对突变率的调节作用

Being synthesized by RNA polymerase, the nascent RNA molecules can fold into various biochemically-active secondary structures that is distinct from mature RNA molecules. We previously found that nascent RNA with stable secondary structure can reduce trascription-induced DNA mutation rate by shortening the R-loop structure formed during transcription. However, the genome-wide effect of nascent RNA secondary structure on transcription-induced mutation rate remain unclear due to the lack of high-throughput data describing nascent RNA secondary structure. We plan to further investigate the nascent RNA secondary structure by conducting the following researches. 1) By a combination of two high-throughput sequencing-compatible protocols, including NET-Seq, which captures nascent RNA, and icSHAPE, which measures in vivo RNA secondary structures, we will develop a new method named NS-Seq,that can probe the nascent RNA secondary structure on a genomic scale. We will apply NS-Seq to S. cerevisiae cells. 2) Develop efficient and accuracte Bioinformatic pipelines for the analyses of NS-Seq data, and provide a comprehensive genome-wide profile of yeast nascent RNA secondary structure. 3) With the measured nascent RNA secondary structure, we will assess its regulatory effect on transcription-induced mutation rate. Results of these researches will reveal the dynamics and complexity of RNA secondary structure, and improves our understanding of the regulation on transcription and mutation, as well as its underlying molecular mechanism.

刚被RNA聚合酶转录合成的新生RNA能形成二级结构，对转录期间发生的众多生物学事件具有潜在调节作用。前期研究中，我们在酵母报告基因系统中发现，稳定的新生RNA二级结构能减少转录诱发的DNA突变。然而由于缺乏高通量检测新生RNA二级结构的数据，新生RNA二级结构在基因组范围对突变率的调节作用尚有待证实。为此，我们拟开展以下研究：1)结合捕获新生RNA的NET-Seq技术，和测定RNA二级结构的icSHAPE技术，建立高通量测定新生RNA二级结构的NS-Seq技术，并应用于酵母基因组。2)针对NS-Seq开发高效的生物信息学分析方法，对酵母新生RNA二级结构进行全面描述。3)根据获得的NS-Seq数据，鉴定新生RNA二级结构在基因组范围对DNA突变率的调节作用。研究结果将实现高通量测定新生RNA的二级结构的创新，加深对RNA二级结构及功能的理解，也将为阐明转录和突变的调节机制提供新的理论基础。

RNA分子除了作为遗传信息的传递者，还通过折叠成复杂的二级和三级结构，在细胞生命活动中发挥基因表达、基因调控、生物催化等各种各样的功能。RNA在从被转录(新生RNA)到转运到细胞内其他位置(成熟RNA)发挥功能的过程中，其结构会发生动态变化，这对于其行使特定功能非常重要。因此，从不同时空范围研究RNA二级结构的动态变化，对全面了解其发挥功能的分子机制至关重要。前期研究中，我们在酵母报告基因系统中发现，新生RNA二级结构能减少转录诱发的DNA突变。然而由于缺乏在基因组范围高通量检测新生RNA二级结构的数据，新生RNA二级结构在基因组范围对突变率的调节作用尚有待证实。我们针对上述问题开展了相关研究。首先，我们开发了NS-seq技术在基因组范围测定正在转录的新生RNA二级结构，首次全面地描绘了新生RNA二级结构的动态变化规律，并证实新生RNA二级结构在基因组范围通过调节R-loop的形成来调控DNA的自发突变率。其次，通过对比新生RNA与成熟RNA，我们发现RNA二级结构存在动态变化的明确证据。如何区分同一基因形成的不同结构中，哪些更可能具有生理功能？我们提出运用“RNA 折叠特异性”来解决该问题。我们发现：特异性折叠比非特异折叠更可能在进化上具有适应性；mRNA 折叠特异性可调控核糖体的暂停，以调控翻译过程；通过分析特异性折叠区域与已知功能的二级结构区域的对应关系，我们发现已知功能的二级结构区域具有更强的折叠特异性。因此 mRNA 折叠特异性是一个潜在的鉴定功能二级结构的分子特征，将成为当前研究RNA功能基因组学的重要工具。 综上，本项目从RNA二级结构的时空动态变化角度揭示了具有重要功能和进化意义的RNA结构组学的新方向，为更深入认识mRNA二级结构的功能，其影响基因序列进化的机制，乃至分子内相互作用的进化模式提供了新思路。