山羊体细胞核移植胎盘发育异常相关microRNA的筛选及功能研究

体细胞核移植(克隆)技术已成为生产药物蛋白、制作转基因动物等领域具有明显优势的技术平台，具有显著的学术价值和经济前景。然而，克隆胚胎妊娠率低一直是制约克隆技术发展及应用的瓶颈，胎盘发育异常是造成妊娠率低的关键因素之一，胎盘细胞基因表达错误是胎盘发育异常的主要因素。微RNA(microRNA，miRNA)能在基因转录后翻译阶段特异性地调控机体器官发育，并具有活体基因干扰的优势，有可能成为解决克隆胎盘基因表达异常的新途径。据此，本项目拟以胎盘双核细胞为研究对象，采用抑制性消减杂交技术和基因芯片技术筛选出克隆胎盘差异表达miRNA，通过生物信息学分析其调控通路，再利用RNA干扰技术，将差异miRNA导入培养细胞或活体，观察细胞生长，检测妊娠相关蛋白及活体胎盘的变化，研究差异表达miRNA的功能，从miRNA角度阐明克隆胚胎胎盘发育异常的分子机制，为提高克隆妊娠率提供新思路和理论依据。

本课题根据miRNA的调控特点，从基因转录后翻译水平，对克隆动物胎盘发育异常的深层次理论问题进行了探索：(1)利用二代测序技术对转基因克隆胎盘及正常胎盘进行了转录组(RNA-Seq)及miRNA (miRNA-Seq)高通量测序，并进行联合分析，筛选出了克隆胎盘差异mRNA 393个和差异miRNA 694个，并建立了相应文库。进而，利用生物信息学方法对这些差异mRNA和miRNA功能进行聚类分析，结果表明，它们主要参与胚胎着床、妊娠、组织和器官发育、血液生成及循环、激素调控等生物过程；调节细胞外基质受体互作、细胞骨架调节、细胞粘附、细胞调亡等信号通路；与酶催化活性、（蛋白、生长因子等）结合、信号传导及凋亡等生物学功能相关；(2)建立了稳定的双核细胞和滋养层细胞分离、培养及鉴定技术体系；(3)转染差异miRNA的mimics到滋养层细胞或活体胎盘外殖子，验证差异miRNA的生物学功能，结果上调差异miRNA显著抑制了滋养层细胞及胎盘外殖子的增殖、迁移及侵袭能力，而下调差异miRNA促进了这些功能。这些结果表明，与正常胎盘相比，转基因克隆胎盘的基因表达谱及miRNA表达谱存在显著差异，这些差异基因功能的变化与克隆胎盘的组织形态学异常（如子叶减少或缺失、胎盘过度生长、滋养层细胞侵入异常，血管畸形等变化）相一致。据此，我们推测克隆胎盘异常的分子机制可能是基因在转录水平及转录后水平的调控出现了异常，导致了胎盘形态学异常、妊娠率低或妊娠失败等宏观症状，严重地影响了胎儿的发育及后代的健康。