山羊绒周期发育中microRNA的鉴定和功能研究

It has been proved that the capacity of Goat Cashmere production has relations with secondary hair follicle in the skin. The periodic regeneration of secondary hair follicles and complex molecular regulation mechanism controlling the growth of cashmere are closely related to cashmere yield and quality. Some research has been conducted on their related genes and regulation in human and mice; however, microRNA research on hair follicle development is still in its infancy, and the study of cashmere cycle regulation remains a vacant field. Based on the effects of miRNA on the development of hair follicle, this project was to study the miRNA expression profiles in different stage to identify stage-specific miRNA in distinct hair cycle; furthermore, through the comparison with the transcription of target genes, genome localization and functional study to determine hair cycle-associated key genes and critical chromosomal region affecting the cashmere cycle development and preliminarily investigate the possible regulation mechanism of miRNA in cashmere cyclical regenerations. This project is not only designed to search the significant functional genes but also to provide a theoretical basis and technical support for artificially regulating cashmere growth and developing new strains.

山羊的产绒能力已被证明与其皮肤中的次级毛囊有关，次级毛囊生长期的长短是影响绒长度的重要因素之一，虽然在人和小鼠对皮肤毛囊的基因和调控有了一定的研究，但 microRNA 对毛囊的发育研究仍处于起步阶段，对山羊绒周期的调控研究更是研究的空白。基于microRNA对皮肤毛囊发育的影响，本项目拟通过研究比较绒周期不同时期miRNA的表达谱，鉴定不同时期特异的miRNA和分子靶标；进而通过其靶基因与转录组的比较研究、基因组定位研究和功能研究，确定可能调控绒周期的关键基因，明确影响绒周期发育的关键染色体区域和通路，并初步探讨miRNA对绒毛周期发育的可能调控机制。通过本项目不仅寻找重要的分子靶标和功能基因，也为人工调控绒毛生长、培养生物新品种提供理论基础和技术支撑。

山羊绒周期脱落与再生是一个复杂性状，由微效多基因调控。虽然在人和小鼠对皮肤毛囊周期转换基因及调控有了一定研究，但microRNA对毛囊周期再生研究仍处于起步阶段。本研究以1年中自然生长条件下绒山羊的皮肤为样本，进行山羊绒周期特征性microRNA研究，取得如下成果：.1、构建山羊绒周期miRNA表达谱数据库，得到山羊皮肤已知miRNA 424个，预测新miRNA 964个，获得总miRNA1388个。.2、获得山羊皮肤miRNA的基因组定位图谱。发现山羊皮肤的miRNA簇定位在19条染色体上，在x染色体最多，有10个miRNA簇。.3、筛选获得绒周期不同时期特异的miRNA分子靶标，从生长期、休止期和退行期的特异miRNA靶标分别为41、39和109个。对其靶基因功能研究表明绒生长过程中，毛囊细胞发生剧烈变化，受多种因子调控，代谢旺盛。.4、 进行microRNA调控绒毛周期启动的机制研究。通过聚类分析表明cluster11基因的表达与绒的生长规律一致 ，其29个基因为角蛋白和角蛋白关联以及与毛的结构相关的基因。通过microRNA-mRNA联合分析表明wnt信号通路对山羊周期启动具有重要作用。.5、成功构建差异miRNA的靶基因的GO、KEGG调控网络以及Wnt 信号通路的调控网络。筛选出CUL1、SMAD2、SIAH1这3个基因。网络分析表明差异miRNA的靶基因是通过细胞周期的通路发生作用，环境对皮肤毛囊周期的转换具有重要作用。.6、进行microRNA与角蛋白的关联分析，表明miR-195对KAP3.1基因有靶向作用，对绒山羊绒毛启动生长具有正调控作用。同时发现一个新的miRNA Novel-66对多个角蛋白和角蛋白关联蛋白家族起调控作用。.7、 进行miRNA靶基因EGFR，ITA5，CHP1，FZD6，SIAH，SMAD2和KAP24-1、KAP3-1和KAP8-1的表达研究，表明上述靶基因在生长期均有高表达。并对波形蛋白在绒毛周期发育的作用进行研究，发现VIM基因在绒山羊皮肤生长期高表达，并通过毛囊外根鞘发挥作用。.8、 成功构建KAP3-1和FZD6表达载体，双荧光素酶实验确定MIR-195与KAP3-1和FZD6在293细胞中不存在靶向关系。.本项目是山羊绒周期转换调控的深入研究，旨在为人工调控绒毛生长方案的制定依据，也为绒山羊分子育种奠定基础。