天蓝色链霉菌孤立组氨酸激酶uHK01的生物学功能及其调控机制研究

链霉菌可以产生许多重要的次生代谢产物，这些产物的合成受到严格调控。天蓝色链霉菌是研究链霉菌次生代谢调控的模式菌。该菌存在大量的TCS，除了典型TCS[由组氨酸激酶（HK）和应答调节蛋白（RR）组成]之外,还含有很多的不成对HK和RR等非典型TCS。目前的研究发现典型TCS在次生代谢中起着重要的调控作用。但关于不成对HK的研究至今未见报道，它们如何发挥功能？是否存在与典型TCS类似的调控机制？鉴于此，本项目在已有工作基础上，将对具有明显功能的孤立组氨酸激酶uHK01的生物学功能及调控机制进行深入研究。拟结合基因芯片、酵母双杂交及凝胶阻滞试验等技术筛选uHK01下游的应答调控蛋白及其靶基因，从而确定其在天蓝色链霉菌的次生代谢与形态分化发育过程中的调控机制。同时，通过交叉互补试验确认不同链霉菌来源的uHK01同源类似物的功能相似性，为工业上改造重要抗生素生产菌提供很好的候选基因。

通过本项目研究，我们在链霉菌中首次鉴定了一个新的参与次级代谢和形态分化发育全局性调控的孤立组氨酸蛋白激酶，命名为uHK01（后来重新命名为OhkA）。该激酶编码基因ohkA (sco1596)的缺失可以导致抗生素ACT，RED以及CDA等过量产生及形态分化异常，气生菌丝及孢子形成受损，仅形成非常短的孢子链。通过转录谱分析（DNA芯片）结合real-time RT-PCR (qPCR)与RNA dot-blot分析表明，OhkA不仅参与以上3种抗生素的合成调控，而且还与黄色色素yCPK的合成密切相关。在ohkA缺失突变体中，这些次级代谢产物的合成基因簇的转录水平都显著上调；同时，一些参与合成次级代谢的前体物-丙二酰CoA的酶基因的转录水平也相应提高。在形态分化方面，与原始株相比，突变体中参与气生菌丝形成的2种表面活性分子Chaplin和SapB的编码基因（chp和ramS）出现了有趣的转录变化，即所有chp基因的转录显著下调，而本身处于低水平表达的ramS转录则急剧上升。另外，突变体中与形态分化发育及其调控相关的许多重要基因也都在转录水平出现了变化，如与气生菌丝形成相关的bldD/N/M，与孢子产生有关的whiG/H/I等基因转录显著下调。ohkA同源基因（氨基酸序列同源性高于80%）广泛存在于不同链霉菌中，对重要工业用抗生素产生菌--除虫链霉菌中的ohkA同源基因（ohkAsav, sav_6741）进行研究证实，ohkA同源基因在不同链霉菌中可能起着类似的调控作用。ohkAsav的缺失可以使突变体中寡霉素A产量显著提高，气生菌丝及产孢受阻。交叉互补实验表明，即将ohkAsav交叉互补至天蓝色链霉菌ohkA突变体，或将ohkA基因互补至除虫链霉菌8165的ohkAsav突变体，抗生素合成及形态分化异常都恢复至相应野生型表型，从而证实了OhkA和OhkAsav的功能相似性。以上结果证明，OhkA及其同源蛋白可能是链霉菌中参与抗生素合成及形态分化的保守的重要调控基因，为重要工业用链霉菌的定向遗传改造提供了很好的基因靶点。相关研究结果已于2011年发表于细菌学权威期刊Journal of Bacteriology.