蜘蛛毒素来源的Nav1.5通道抑制剂的结构功能及抑制乳腺癌转移的分子机制研究

Voltage-gated Nav1.5 sodium channels are an important transmembrane protein family and also be one of important targets of drugs. They are widely distributed in human tissues such as cardiomyocytes and cancer cells, and play important role in the regulation of cardiac excitation-contraction coupling and cancer metastasis. Jingzhaotoxin-III、-IX、-XIV are Nav1.5 sodium channel modulators isolated from the venom of the Chinese venomous tarantula Chilobrachys jingzhao. This study will investigate different selectivity of the three spider peptide toxins on a variety of cloned sodium ion channel subtypes and modulation effect on the human Nav1.5 sodium channels. Using electrophysiolog-ical techniques and molecular biology techniques such as sodium channel site-directed mutagenesis, we will reveal key active sites of interactions and molecular mechanism of different affinity between the Nav1.5 sodium channel subtypes and jingzhaotoxins. In order to determine the key residues of jingzhaotoxins responsible for binding Nav1.5 sodium channels and to further improve subtype selectivity and specificity of the toxins on sodium channel, mutants of native jingzhaotoxins will be synthesized by solid-phase method. We hope that this study will provide a theoretical basis in applications of spider peptide toxins in neurobiology as well as design and development of anti-cancer lead molecule.

电压门控Nav1.5钠通道在调节心肌兴奋收缩耦联、肿瘤侵袭转移等方面起重要作用，是一种重要的跨膜结构蛋白，也是治疗药物作用的重要靶标之一。JZTX-III、-IX和-XIV是从我国特有珍稀捕鸟蛛的毒液中分离到的钠离子通道调制剂。本课题将研究JZTX-III、-IX和-XIV对多种钠通道亚型的选择性以及对钠通道亚型Nav1.5通道的激活、失活、去激活等的调制作用。运用钠通道定点突变等技术和电生理技术，揭示Nav1.5通道与蜘蛛活性肽发生相互作用的关键活性位点以及对多肽呈现不同亲和力的分子机制。运用多肽固相合成技术合成多肽突变体，分析目的多肽结合Nav1.5通道的关键残基，从而提高目的多肽对钠通道亚型的选择性和专一性。在细胞和动物水平上，研究它们对乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响及可能的分子机制。期望此课题的开展能为蜘蛛活性肽在神经生物学等方面的应用和抗肿瘤药物先导分子的设计开发提供理论基础。

电压门控钠离子通道在癌症细胞中的表达水平与某些癌细胞的转移能力相关，针对癌症相关钠离子通道的研究是当前离子通道领域的研究热点之一。敬钊缨毛蛛和穴居狼蛛是在我国海南省发现的具有很强毒性的大型蜘蛛。我们从蜘蛛毒液中鉴定出了多种具有影响离子通道活性的多肽成分，并且选择了其中三种多肽成分（JZTX-XIV， VL-21,KL-23）进行深入研究。. 敬钊毒素-XIV（JZTX-XIV）是从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素。 JZTX-XIV是Nav1.5通道的一种高效抑制剂，JZTX-XIV对Nav1.5的抑制作用呈现明显的时间依从性。JZTX-XIV可以使Nav1.5通道的稳态激活曲线向去极化方向发生显著性漂移，引起稳态失活曲线向超极化方向发生显著性漂移。因此推断JZTX-XIV是钠通道的一种门控调节型毒素。JZTX-XIV对Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv2.1、Kv4.2和Kv4.3钾通道电流几乎没有抑制作用，说明JZTX-XIV的选择性比较强。JZTX-XIV能明显抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭转移。JZTX-XIV对 MDA-MB-231细胞的增殖无明显抑制作用。多肽处理后，MMP2和MMP9这两种肿瘤细胞迁移相关的蛋白质有明显变化，可能与JZTX-XIV的作用密切相关。. VL-21和KL-23是从蜘蛛毒液分离的两种活性多肽。CCK8实验表明，活性多肽VL-21和KL-23对三株乳腺癌细胞的增殖有明显抑制作用。伤口愈合实验表明，多肽VL-21对乳腺癌细胞迁移能力有明显抑制作用，并且呈现剂量-时间依赖效应。Hoechst/PI双染实验显示，VL-21可能诱导乳腺癌细胞坏死途径死亡，KL-23可能诱导乳腺癌细胞凋亡途径死亡。多肽VL-21和KL-23能显著提高乳腺癌细胞的ROS水平，可以显著提高乳腺癌细胞的ATP释放水平，并具有浓度依赖效应。