蜘蛛毒素抑制钾离子通道亚型Kv2.1的分子机制研究

钾通道亚型Kv2.1广泛分布于中枢、中间神经元以及胰腺β细胞上，负责动作电位复极化相形成，可调节细胞兴奋性,也是II型糖尿病药物的重要作用靶点。在前期工作中，我们从我国特有敬钊缨毛蛛毒液中报道了四种多肽毒素为Kv2.1阻断剂，亚型选择性高、活性强，是深入研究Kv2.1结构与功能关系的重要工具试剂和开发成治疗糖尿病药物的候选者。四种多肽毒素阻断Kv2.1通道的分子机制和对胰岛细胞离子通道活性影响还不清楚。本课题拟通过基因表达获得毒素突变体，分析毒素关键残基；通过构建离子通道突变体和蛋白质相互作用对接（docking），深入揭示蜘蛛毒素抑制Kv2.1通道的分子机制；通过急性分离大鼠胰岛细胞，检测多肽毒素对胰岛细胞钾通道、动作电位及葡萄糖诱导胰岛素分泌的影响。研究结果将加深对Kv2.1通道结构与功能关系的理解，同时为该多肽毒素开发治疗糖尿病提供实验依据。

Jingzhaotoxin-III(JZTX-III)特异性地抑制Navl. 5和Kv2. 1通道激活。为了阐明JZTX-III与Kv2. 1通道相互作用的分子机制，我们研究了 JZTX-III结合该通道的生物活性表面和结合受体位点。实验结果表明JZTX-III能够捕获Kv2. 1通道的电压敏感元件，抑制Kv2. 1通道激活。丙氨酸替代电压敏感桨叶结构（S3b～S4)上的六个氨基酸残基Phe274、 Lys280、Ser281、Leu283、Gln284和 Val288 均大于 7 倍地降低了 JZTX-III的亲和力。其中，位于Kv2.1 S3～S4胞外连接环上的Ser281是最关键的受体残基，该氨基酸残基被丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和谷氨酸替代后均能降低毒素的亲和力大于34倍。JZTX-III结合Kv2.1通道的生物活性表面由四个疏水性残基(Trp8、Trp28、Trp30 和 Val33)以及三个电荷残基(Argl3、Lysl5 和Glu34)组成。虽然三个疏水性残基（Trp8、Trp28和Trp30)构成的疏水性斑片在JZTX-III结合钠通道Navl. 5和钾通道Kv2. 1的生物活性表面上重叠，但JZTX-III抑制Navl.5和Kv2.1这两种通道亚型的生物活性表面并不完全等同。. Jingzhaotoxin-1、-IX 和-XI (JZTX-I、-IX 和-XI)它们能够加快Kv2. 1通道的去激活动力学，使通道从激活状态往关闭状态转换。三种毒素抑制抑制Kv2.1通道的IC50值分别为8. 05、1. 35和0. 57μ M。定点突变分析结果显示该通道S3b～S4电压敏感浆叶结构上的四个氨基酸残基(Ile273、Phe274、Glu277和Lys280)是决定JZTX-I结合Kv2. 1通道的关键受体残基，形成了 JZTX-I结合Kv2.1通道的受体位点。位于S3b片片段上的三个氨基酸残基(Ile273、Phe274和Glu277)也是决定JZTX-IX和JZTX-XI结合Kv2. 1通道的关键残基。考虑到这些毒素都能够加快通道的去激活动力学，结果表明这三种蜘蛛毒素结合Kv2.1通道的受体位点部分重叠，均采用捕获静息状态电压敏感元件的方式抑制Kv2. 1通道的激活。