基于基因改造提高重组粘细菌黄曲霉毒素降解酶热稳定性的研究

Aflatoxins (AF) are a group of strong cancerogenic mutagens with great toxicity and stability, doing much harm to human beings and animals. Increasing number of researchers has focused on using the bio-enzymes to degrade aflatoxins because of its safety, efficacy and low costs. Our research group had screened one strain of Myxococcus fulvus which could degrade above 78% AF. Moreover, the full-length of Myxococcus fulvus aflatoxin degrading enzyme (MADE) cDNA sequence had been obtained and the recombinant protein had been expressed in Escherichia coli (rMADE). However, the thermostability of rMADE was low and could not be applied in industrial production. Therefore, in this research, protein engineering with computer technology will be used to screen amino acid sites that play a key role in the thermostability of rMADE and rMADE would be modified by site-directed mutagenesis. In addition, the enzymatic properties and protein structure of rMADE will be analyzed and the mutant with high thermostability (GM-rMADE) will be obtained. Moreover, the degradation mechanism of GM-rMADE will be revealed by analyzing degradation products. Finally, the thermostability of GM-rMADE will be verified by heat treatment and feed granulation and the protective effect of heat treated GM-rMADE on broiler liver cells contaminated by AF would be validated by cell test. The results will lay the foundation for the exploiting rMADE as efficient and safe feed additive of mycotoxin degradation enzyme.

黄曲霉毒素（AF）对人和动物危害巨大，生物酶降解AF法因具有安全环保、解毒彻底、特异性强等优点备受研究者的关注。申请人前期工作筛选到一株对AF降解率达78%以上的粘细菌，并实现了粘细菌黄曲霉毒素降解酶基因（MADE）在大肠杆菌中的重组表达，但该重组酶（rMADE）热稳定性差，限制了其在饲料生产中的运用。因此，本项目旨在利用蛋白质工程与计算机模拟相结合的方式筛选对rMADE热稳定性起关键作用的氨基酸位点，采用定点突变对rMADE进行基因改造并对改造前后rMADE的酶学特性和蛋白结构进行分析，筛选出热稳定性高的突变体（GM-rMADE）；再利用质谱和核磁技术分析降解产物的结构，揭示其催化降解AF的作用机理；最后，通过实验室模拟热处理和饲料制粒，并结合离体细胞试验，验证高温处理后GM-rMADE降解AF的效果，为此重组酶作为高效、安全的AF降解酶饲料添加剂奠定基础。

黄曲霉毒素（AF）对人和动物危害巨大，生物酶降解AF法因具有安全环保、解毒彻底、特异性强等优点备受研究者的关注。申请人前期工作筛选到一株对AF降解率达78%以上的粘细菌，并实现了粘细菌黄曲霉毒素降解酶基因（MADE）在大肠杆菌中的重组表达，但该重组酶（rMADE）热稳定性差，限制了其在饲料生产中的运用。本研究首先通过同源建模与计算机模拟相结合的方式筛选对rMADE热稳定性起关键作用的3个氨基酸位点，采用定点突变对rMADE进行基因改造，改造后发现由于建模时模板同源度不高，突变后的蛋白60°C下迅速失活，无法满足实际生产。因此接下来采用定向进化对rMADE进行基因改造。首先，对易错PCR反应条件进行了优化，选择了5 mM Mg2+和0.3 mM Mn2+浓度组合作为易错PCR反应的条件，最终成功构建了一个包含5000多个突变体的突变体库。然后，选用香豆素代替AF作为唯一的碳源初步测定突变体降解AF的能力，建立了高通量的筛选方法，通过HPLC复筛得到T50值比野生型rMADE分别提高了16.5°C （rMADE-1124）、6.5°C（rMADE-1795）和9.8°C（r-MADE-2848）的3个突变体。此外，与野生型相比，rMADE-1795和rMADE-2848的催化活性分别提高了81.5%和67.7%。通过结构分析发现：rMADE-2848中的突变（D114H）将酸性氨基酸替换为碱性氨基酸，增加了与周围残基的极性相互作用，是导致该突变酶t1/2值增加3倍的主要原因。并通过降解产物致突变性分析发现rMADE-2848可将AFB1降解为无毒的代谢产物。最后，通过模拟热处理和饲料制粒，并结合肉鸡饲养试验，验证了rMADE-2848在不同制粒条件下仍在具有高效降解AF的能力，能够缓解AF对肉鸡生产性能、屠体品质、器官指数、肉品质、血液和肝脏抗氧化、毒素残留和肠道菌群的不利影响，为该酶作为高效、安全的耐高温AF生物脱毒酶制剂的开发奠定了基础。