黄曲霉毒素解毒酶催化降解底物的分子机理及其定向改造的研究

Aflatoxin-detoxiczyme(ADTZ) is a kind of enzyme that can degrade aflatoxin, which has been found in the recent years.In this project,we plan to go on a systemic and deep research on the interaction between ADTZ and aflatoxin using the aflatoxin as small molecule probe by computer model technique combined with gene clone and expression and site-mutation and spectrum analysis and molecule orthogenesis and so on, and explore its molecule detoxicated mechanism, in order to gain the accurate and reliable interaction model of enzyme-ligand and confirm fundamental catalyzed pathway and to find out rate-determining step. Based on this research, we will do some research on the design and screen and rebuilt of ADTZ and hope to gain new ADTZ with high activity and broad spectrum and promising prospect.This work will provide reasonable design guidance and necessary research base for the creation of new ADTZ which possess proprietary intellectual property rights.

黄曲霉毒素解毒酶（Aflatoxin-detoxiczyme, ADTZ）是近年发现的具有降解黄曲霉毒素，降低黄曲霉毒素毒性的一种酶。本项目拟综合运用计算机辅助分子模拟技术、基因克隆表达、定点突变、光谱分析及分子定向进化等技术，以黄曲霉毒素为小分子探针，以ADTZ蛋白为靶标酶，系统深入地研究ADTZ蛋白与黄曲霉毒素之间的相互作用机理，探讨ADTZ催化降解黄曲霉毒素的分子机理，以获得准确可靠的酶-配体相互作用模型，确定酶催化的基本反应途径，找出决速反应步骤。在此基础上，对ADTZ进行设计、定向改造、筛选的研究，可望获得新型高效、稳定、广谱的具有应用前景的黄曲霉毒素解毒酶，为我国开发具有自主知识产权的新型黄曲霉毒素解毒酶的创制工作提供合理的设计指导和必要的前期研发基础。

黄曲霉毒素(aflatoxin, AFT)给农业生产、食品安全、公众健康等都带来了危害，被称为新的“万病之源”。 AFT解毒去毒研究显得尤为迫切重要。为此，我们开展了相应的研究并取得以下研究结果。.第一、本项目研究中我们通过生物信息学、蛋白表达纯化等技术对编码黄曲霉毒素降解酶的基因进行优化分析，获得与原始序列相似度为78%，高效的具有应用前景的黄曲霉毒素解毒酶。对这部分工作我们申请了专利。.第二、运用了计算机辅助分子模拟技术、基因克隆表达、定点突变、光谱分析等技术，以黄曲霉毒素为小分子探针，以黄曲霉毒素降解酶（ADTZ）为靶标酶，预测了ADTZ与底物AFB1的结合模式，推测ADTZ可能存在两种降解机理：Ⅰ. 基于水解反应机理推测黄曲霉毒素降解酶与底物的相互作用。其中起到重要作用的水解类氨基酸残基有10个。Ⅱ. 基于氧化还原反应机理推测黄曲霉毒素降解酶与底物的相互作用。其中起重要作用的氨基酸残基有13个。通过定点突变及表达纯化获得了突变体蛋白。通过系统分析这些突变体的生化特性，确定这些氨基酸残基在黄曲霉毒素降解酶催化作用中起到不同的作用。.第三、获得并解析了黄曲霉毒素降解酶的第一个晶体结构，这为我们进一步深入研究黄曲霉毒素降解酶的作用机理、定性改造黄曲霉毒素降解酶以获得适应不同条件的稳定的黄曲霉毒素降解酶奠定了坚实的基础。.总之，本项目综合运用了计算机辅助分子模拟技术、基因克隆表达、定点突变、光谱分析及分子定向进化等技术，以黄曲霉毒素为小分子探针，以黄曲霉毒素降解酶（ADTZ）为靶标酶，系统深入地研究了ADTZ的生化指标，探讨了ADTZ与黄曲霉毒素之间的相互作用机理，以及ADTZ催化降解黄曲霉毒素的分子机理，获得了高效的具有应用前景的黄曲霉毒素解毒酶。为我国开发具有自主知识产权的新型黄曲霉毒素解毒酶的创制工作提供了合理的设计指导和必要的前期研发基础。