微生物降解黄曲霉毒素的作用及其相关酶的研究

黄曲霉毒素污染不仅给人类和动物的健康带来极大危害，而且造成巨大经济损失，是国际社会关注的食品安全重大问题。因而研究生物降解转化黄曲霉毒素在理论和实践方面有着较大意义。我们在前期工作中，筛选得到了4株可降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的微生物，包括3株细菌和1株真菌。经重复验证，HPLC分析，发现AFB1被这4种微生物降解，并出现了新的产物，其中1株细菌对AFB1的最高降解率达到80%。为进一步了解转化产物和相关酶的特性，本研究拟在前期工作基础上，进一步对筛选的有降解活性的微生物进行比较鉴定；对目标微生物降解AFB1的代谢产物的性质，毒性进行分析，对相关酶进行分离研究。这将对进一步研究AFB1的生物降解，以及生物降解的分子机制和基因表达调控提供方法和理论依据。

黄曲霉毒素是丝状真菌产生的具有强毒、致癌的次级代谢产物，常常造成农产品和食品的严重污染。在防控真菌毒素中，生物降解，尤其微生物的作用一直受到重视。本项目以微生物降解黄曲霉毒素B1(AFB1)为目的展开研究，主要研究结果如下。.以AFB1结构类似物香豆素为唯一碳源，筛选到10株AFB1降解菌，其中从金毛羚牛粪便中筛选出的菌株F4降解活性最好。F4菌的培养液在37℃与AFB1作用72h，去除率达90.0%。经多相鉴定，F4属于施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri)。.F4的活性物质主要存在于细胞内。pH和温度对降解水平影响显著，Mg2+对AFB1降解有增强作用，降解率增加7.68%，Cu2+抑制降解活性，降解率下降51.1%。同时分析了F4降解毒素的影响条件，最佳降解条件为：温度35℃、pH7.0、Mg2+ 1.0 mM，此时AFB1降解率达97.34%。.蛋白酶K和SDS对F4的活性蛋白有抑制或破坏作用，使降解活性有较大下降。经过AFB1诱导的F4对毒素进行降解时，降解率未见明显提高。结果表明，F4产生的能够降解AFB1的活性物质为生物酶，且该酶为非诱导性胞内酶。.一级四极杆飞行时间质谱检测表明降解产物2的分子量206.0564，分子式C11H10O6。二级Q-TOF检测发现产物2与AFB1有多个离子碎片相似，表明产物2与AFB1母体同源性很高，进一步确定了其为AFB1的降解产物。对产物2的极性、降解前后降解液的pH变化及产物2的二级质谱碎片结构进行逐步分析，得到产物2可能的结构式，为6-甲氧基-[4,9]苯并-2,10,11,13-四氢-[11,13-环氧乙烷]双呋喃，从而明确了AFB1转化为产物2的降解途径。.Ames试验结果表明，AFB经F4生物降解后，致突变性显著降低，降解产物的致突变性可被定为致突变阴性，即低毒或无毒。说明F4将AFB1降解为低毒或者无毒的产物。.通过硫酸铵沉淀、离子交换和分子筛层析纯化AFB1降解酶(AFB1- degrading Enzyme, ADE)，ADE被纯化了123倍，比酶活为64×103 U/mg。ADE相对分子质量约为24 kDa；最适反应条件为30℃、pH6.0；Cu2+对ADE酶有抑制作用，Mg2+、Zn2+、Mn2+和Fe3+影响不大；表观Km值为5.61×10-5 mol/L。