X连锁凋亡抑制蛋白参与铅暴露抑制室管膜下区神经发生的“铜开关”调控机制研究

Neurogenesis in adult brain is important to maintain brain function and repair its impairments. It has been reported that lead (Pb) exposure results in aberrant adult neurogenesis, which may be a reasonable cause for Pb-induced brain function deficit and neurodegenerative disorders; however, the underlying mechanisms are not clear. Recent studies have found a strong negative correlation between the ability neurogenesis in the subventricular zone (SVZ) and its copper (Cu) level, suggesting that Cu may be an important factor in the neurogenic niche influencing adult neurogenesis. Our preliminary study found that Pb exposure led to intracellular Cu overload, accompanying with altered expression levels of several proteins relate to Cu metabolism, such as X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), and Copper Metabolism MURR1 Domain-containing 1 (COMMD1). Thus, we hypothesized that Pb exposure may impair the neurogenesis in SVZ by inducing Cu overload in neural stem cells. In this program, we planned to begin our research by investigating the impact of Pb on the Cu level in neural stem cells, and clarify the key factor in the regulatory mechanism underlying Pb-induced impairment of SVZ neurogenesis. The core part of this program is to elucidate the effect of intracellular Cu levels on the XIAP-mediated ubiquitination and degradation of CCS and COMMD1, and to determine the regulatory role of this “Cu switch” in Pb-induced impairment of SVZ neurogenesis. This study will be helpful to further clarify mechanisms of Pb-induced neurotoxicity, and provide a new research angle and experimental base for its prevention and medical treatment.

成年大脑神经发生对于脑功能的维持和损伤的修复具有重要作用。研究发现铅暴露能够抑制大脑神经发生，从而为其损伤脑功能及促进神经退行性病变的原因提供了一种可能的解释，但其作用的分子靶点和调控机制并不清楚。室管膜下区（SVZ）的铜水平与其神经发生能力负相关，表明铜可能是大脑微环境中影响神经发生的重要因素。我们前期研究表明：铅可诱导细胞铜蓄积，并影响XIAP、COMMD1等铜代谢相关蛋白的表达。由此我们推测铅暴露可能通过诱导神经干细胞铜蓄积而抑制SVZ神经发生。本项目拟以铅暴露影响SVZ神经干细胞铜蓄积的规律为切入点，明确铅损害神经发生的关键因素和分子调控机制，重点探讨铅暴露后细胞铜水平变化对XIAP介导CCS、COMMD1泛素化降解的影响，以及此“铜开关”对SVZ神经发生障碍的调控作用。本项目研究结果将为阐明铅损害神经发生功能的机制、寻找有针对性的医学防治策略提供新的研究角度和实验基础。

本项目采用铅暴露诱导大脑SVZ神经干细胞增殖抑制的动物模型和体外细胞模型，研究铅暴露所诱导大脑铜元素蓄积的作用及对CTR1、ATP7A、ATP7B等铜转运蛋白的影响，揭示大脑铜蓄积对神经干细胞增殖抑制和氧化应激损伤的诱导作用，重点阐明X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在铅暴露引起神经干细胞增殖抑制中的调控机制，并证实铜螯合剂和抗氧化剂干预的保护效果。本研究主要取得一下几个方面的进展：（1）建立了孕期和生长发育期铅暴露小鼠模型，证实在不同阶段的铅暴露均可显著抑制SVZ神经干细胞的增殖。（2）建立了铅暴露体外大脑屏障细胞模型，揭示了铅通过降低XIAP蛋白水平，特异性负向调控COMMD1-ATP7B途径，进而诱导脑组织铜蓄积的重要分子机制。（3）建立了铅暴露C17.2神经干细胞体外模型，发现铜蓄积可显著促进ROS产生和过氧化损伤，并降低SOD1活性；发现了XIAP和CCS蛋白水平变化对SOD1的活性具有正向调控作用。（4）利用C17.2神经干细胞和可诱导CTR1高表达细胞株，证实细胞铜水平的增高对SOD1活性和细胞增殖的影响具有“开关”（阈值）效应，表现为铜水平轻微增高时促进、而铜水平增高幅度较大时则抑制。证实了铜作为一种必需微量元素，其正常的生理水平范围的维持对于促进机体发育和维持氧化-还原平衡非常重要，而铅暴露引起的脑内铜水平增高，可以诱导氧化应激损伤，促进包括神经退行性疾病在内的各类相关疾病发生。（5）使用特异性铜螯合剂四硫代钼酸铵（TTM）降低脑组织和细胞培养体系中的铜水平，或使用抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），可以部分逆转铅暴露引起的氧化应激损伤及神经干细胞增殖抑制。综上，本研究初步揭示了铅暴露所引起的铜代谢紊乱对其神经毒性具有重要的促进作用，并阐明了XIAP、CCS、COMMD1、ATP7B等铜代谢相关分子在其中的重要作用及调控机制，为进一步从脑内铜金属元素稳态的失衡的角度阐明铅神经毒性的机制、探索有效的预防干预措施，提供了新的研究角度和重要的研究基础。