错配修复基因hMLH1在雌激素诱导结肠细胞凋亡中的作用

Estrogen is reported to have a protective effect on colorectal cancer. However, the underlying mechanism is unclear. We have reported estrogen increased the expression of mismatch repair (MMR) gene hMLH1 as well as MMR function in colonic cells. And re-expressing hMLH1 in HCT116 cells can increase estrogen-induced apoptosis significantly. According to this, we supposed that estrogen might prevent colorectal cancer through hMLH1-dependent colonic cells apoptosis. In this study, we will assess the role of hMLH1 in estrogen-induced colonic cells apoptosis and the potential mechanism. Firstly, we will check whether hMLH1 participates in estrogen-induced apoptosis throuth knocking-down and re-expressing in cultured cells. Then the pathway involved in apoptosis will be checked through signaling molecules detection. Moreover, the interaction between hMLH1 protein and apoptosis signaling molecules will be investigated through transcription and co-immunoprecipitation analysis. Finally, we will check the results in animal models. This findings will be important in colorectal cancer chemoprevention by estrogen analogues.

临床和流行病学研究证实雌激素有预防结直肠癌的效果，但具体机制不明确。我们前期研究发现，雌激素能上调结肠细胞错配修复基因hMLH1的表达，增强错配修复功能；而在hMLH1缺陷的结肠癌细胞株中再表达hMLH1，能明显增强雌激素诱导的凋亡。因此推测雌激素可能通过hMLH1基因促进了结肠细胞凋亡的发生，从而起到预防结直肠癌的作用。本项目将进一步研究hMLH1基因在雌激素诱导结肠细胞凋亡中的作用和分子机制。我们将首先在体外培养细胞中通过敲低和再表达，明确hMLH1表达对雌激素诱导结肠癌细胞凋亡的影响，然后通过检测凋亡信号分子的表达和活性明确其涉及的凋亡通路，并通过转录分析和免疫共沉淀研究hMLH1蛋白与凋亡信号分子相互作用的方式，最后在动物模型内验证雌激素对hMLH1和凋亡的影响。本研究是对雌激素预防结直肠癌机制的进一步探索，为雌激素类似物用于结直肠癌的化学预防提供理论依据。

流行病学研究表明，雌激素具有预防结直肠癌发生的作用，但雌激素预防结直肠癌的具体机制尚不明确，错配修复（mismatch repair, MMR）蛋白可能是其中较关键的因素之一。我们基于前期研究结果推测雌激素可能通过hMLH1基因促进了结肠细胞凋亡的发生。因此本项目研究了hMLH1基因在雌激素诱导结肠细胞凋亡中的作用和机制。我们在体外培养细胞中明确了hMLH1对雌激素诱导结肠癌细胞凋亡的影响和涉及的通路，并在动物模型中验证了雌激素对hMLH1和凋亡的影响。我们使用了两种MMR蛋白缺陷的人结肠癌细胞株：hMLH1缺陷的HCT116细胞，和hMSH2缺陷的LoVo细胞。通过转染hMLH1和hMSH2野生型cDNA，又构建了相应的MMR蛋白正常的细胞株。在给予雌二醇（17β-estradiol, E2）处理后，观察不同MMR状态的细胞活性和凋亡率的改变，以及凋亡相关蛋白表达的变化。同时，也研究了过表达雌激素受体β（estrogen receptor β, ERβ）蛋白对结肠癌细胞凋亡的影响。结果发现，E2仅在hMLH1蛋白正常表达的结肠癌细胞中引起凋亡；而在hMLH1蛋白表达缺失的结肠癌细胞中，E2并不能引起明显的凋亡反应。过表达hMSH2或ERβ也能诱导结肠癌细胞凋亡，但这种效应与E2处理无关。即使在hMSH2缺陷的LoVo细胞中，过表达hMLH1蛋白也增强了E2诱导的细胞凋亡反应。我们又在双侧卵巢切除的裸鼠皮下肿瘤种植模型中，观察了ERβ激动剂DPN和ERβ拮抗剂PHTPP对MLH1表达、肿瘤细胞生长和凋亡的影响。发现DPN能提高MLH1的表达，促进皮下种植的结肠癌细胞凋亡，并抑制癌细胞的生长。以上体内和体外试验说明，雌激素导致的结肠癌细胞凋亡是依赖于错配修复蛋白hMLH1的，hMLH1蛋白能增强雌激素诱导的结肠癌细胞凋亡，但这一过程可能独立于错配修复系统的错配识别和修复能力。本研究结果提示，在接受雌激素替代治疗前、或使用雌激素类似物预防结直肠癌前，应该评估患者错配修复蛋白状态，以使效益/风险比最大化。