促凋亡基因zPuma 在溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡中的作用

The environmental toxic effect of pesticides is becoming more important. Zebrafish had been extensive used to assess the toxicity of pesticide. Apoptosis is one of academic hot spots in ecotoxicology. PUMA gene may play important role in the signal pathways and molecular mechanisms of apoptotic process. In recent study, the result indicated that zPuma played key role in apoptosis of zebrafish embryo induced by cyantraniliprole. It were limited that the reports of relationship between zPuma gene including genetic mutation, Bh3 domain variation, express of mRNA or protein and apoptosis induced by pesticides. Hence, this research will gain the zPuma gene knockdown zebrafish based on CRISPR-Cas9 method. The study on zebrafish embryos gene knockdown and wild type zPuma and other apoptosis related signal pathway and protein expression, in order to analyze its toxic effects on zebrafish apoptosis network, and investigate the effects of the zPuma gene in apoptosis of embryo induced by pesticide at the level of transcription and translation. In order to investigate the molecular mechanism of apoptosis of embyo induced by pesticide. Therefore, this study can provide scientific basis for environmental risk assessment and the intelligent use of pesticides.

农药污染是长期存在问题，斑马鱼在农药毒理学中广泛应用。细胞凋亡是生态毒理学研究热点之一。PUMA基因是凋亡通路中重要基因。申请人前期研究证明，zPuma基因在溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡中可能发挥重要作用。目前鲜见关于zPuma基因突变、BH3结构域变异、mRNA和蛋白质表达与农药诱导细胞凋亡之间关系研究报道，本项目拟通过研究，在转录或翻译水平明确受抑制导致zPuma表达异常的因子，通过基因编辑技术建立zPuma基因敲除斑马鱼，确定zPuma基因突变、BH3结构域变异、mRNA和蛋白质表达与农药诱导斑马鱼胚胎产生细胞凋亡之间关系，探索zPuma基因在溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡中如何发挥作用，从分子及蛋白水平探讨zPuma在农药诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡中的角色及分子机制，从胚胎层面揭示农药诱导产生细胞凋亡的分子机理，为科学评价农药的生态毒性，农药的合理使用提供理论依据。

（1）完成zPuma基因突变、BH3结构域变异、mRNA和蛋白质表达与农药溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎产生细胞凋亡之间关系，明确是由于转录水平受抑制而导致zPuma的表达异常。.（2）确定zPuma在农药溴氰虫酰胺诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡中的作用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得 zPuma 基因敲除的斑马鱼，研究结果表明， zPuma 基因低表达的情况下，药剂暴露后可诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡，但是细胞凋亡现象较野生型有所减轻；用RT-qPCR 方法进行了3年有关基因如P53、BCL-2、BAX等基因的验证，发现在急性染毒的情况下，基因变化规律性较好，亚致死剂量长期暴露时，各基因的变化规律不显著，用ELISA方法测定Zpuma、P53、GAX等相关蛋白的表达量，发现Zpuma相关蛋白表达量变化规律性较好，可以初步确定 zPuma 基因在溴氰虫酰胺诱导斑马鱼细胞凋亡中的作用。本项目从分子生物学水平以及胚胎层面揭示农药溴氰虫酰胺诱导产生细胞凋亡的分子机理。.（3）在国内外重要学术刊物已发表论文5篇，其中TOP期刊1篇，完成硕士论文4篇，并参与出版英文专著1部，获批国家发明专利2项。