基于微拟球藻突变体对细胞内活性氧损伤的响应解析光合系统对细胞内能量储存的调控

Microalgae are the most simple eukaryotic cells, which are important research materials on cell metabolism and photosynthesis etc. The Nannochloropsis oceanica IMET is a kind of marine microalgae, which have high tolerance to environmental stress, and have high yield of lipid and eicosapentaenoic acid (EPA). As an economic microalgae, it has advantages and potential in production. We have used heavy ion mutagenesis and directed screening to obtain a number of N.oceanica IMET mutant strains, and one of the mutants were re-sequenced and finished the RNA-Seq research. On this basis, this project will analyze the multiple mutants by active oxygen injury. The transcriptome and proteome will be used to analyze the response of the microalgae cells to the reactive oxygen species (ROS). We will focus on the mutations and the differential expressions of the photosynthetic light harvesting proteins and electron transport chain proteins. Combine the photosynthetic fluorescence parameters and cell metabolic network, the mutant genes and metabolic pathways will be evaluated. Furthermore, we will find out the key genes in the process and the results will be verifid by the genetic transformation test. In this project, the storage mechanisms of the energy and reducing power which induced by the ROS injury will be demonstrated in the wild type and mutant strains. We will provide theoretical guidance and methodology for the N. oceanica genetic transformation and production in the future.

单细胞微藻作为最简单的真核植物细胞，一直是研究细胞代谢和光合作用等方面的重要研究材料。拟微球藻作为一种海洋微藻，其环境抗逆性强、油脂和EPA产率较高，作为经济微藻，在生产中具有一定的优势和潜力。本项目前期利用重离子诱变及定向筛选获取了多个拟微球藻突变株，并对其中一株突变体进行了基因组重测序及转录组分析。以此为基础，本课题将对多个突变株受到活性氧损伤后的转录组及蛋白质组进行分析，归纳拟微球藻对细胞内活性氧损伤的响应过程，着重聚焦光合捕光色素蛋白及光系统电子传递链蛋白的突变和表达差异。结合光合荧光参数和细胞内代谢网络信息，对不同突变体在响应过程中存在的基因和代谢途径的差异进行评价和分析，并寻找这个过程中的关键基因；利用遗传转化技术对相关的结论进行验证。通过本课题对拟微球藻野生型和突变株应对细胞内的活性氧损伤而产生的能量和还原力储存机制进行论证。为今后的微藻基因改造和生产培养提供理论依据。

海洋微藻是重要的海洋资源宝库，深入发掘海洋微藻资源对于海洋固碳，海洋渔业等社会和经济问题具有重要意义。本课题利用现有的重离子辐照后经过表型定向筛选的突变体库，研究拟微球藻在活性氧胁迫条件下应激表达的异同。分析在光合系统受损后细胞内的抗氧化应激过程。并在重离子辐照的突变体中针对突变的 4~6个光合系统关键基因进行基因修复，研究在重离子突变体中，光合系统的改变是否是影响突变体性状的关键因素。.经过项目的实施，我们共进行了两个批次的辐照实验，开发了使用单线态氧诱导剂（Rose Bengal）进行高通量筛选的方法，共筛选出20余株具有高效生产能力的突变藻株。并对其中10株突变株进行重测序的分析和转录组分析，通过对相关代谢途径的综合分析，聚焦细胞C4途径的关键限速蛋白PPDK，细胞周期调控蛋白RB进行遗传转化来分析该代谢途径在油脂积累和细胞抗逆过程中的作用。.微藻细胞活性氧的损伤来源于光合系统内过快的氧分子释放，结合细胞与氧之间的作用关系，我们使用基因工程的手段，在细胞中引入表达透明颤菌血红蛋白（VHb）去结合叶绿体内的高浓度氧，来降低叶绿体内的氧浓度，从而降低活性氧损伤以及光呼吸的程度。结果显示VHb能够成功在细胞内表达，并显著提高细胞的生物量和高光下的光合系统参数。因此我们提出的该方案为今后从理论和策略上提高微藻培养过程中逆境耐受提供了帮助。.同时，我们也在近年的工作中布局了规模化培养的相关工作，对我们筛选得到的突变株进行了中试规模（500 L培养体系）的验证，并在云南的企业生产基地完成了示范规模（10吨级）的实验。最终在室外中试培养体系下，EPA占油脂的含量达到27%~31%，较野生型提高了近50%，EPA产量达到32.7 mg/L/day，具备了进行规模化生产的条件。.该工作在不同方向上解释了重离子诱变突变株的突变机制。为今后的微藻培养和基因改造提供理论依据。