百菌清水解脱氯酶Chd的催化机制研究及酶的改造

微生物编码的脱氯酶在氯代芳香族化合物的脱毒、降解方面起着关键作用，是当先国际研究的热点。氯代芳香族化合物的脱氯方式主要有还原、巯基取代、氧化和水解，而关于水解脱氯酶的脱氯机制只有4-氯苯甲酸脱氯酶的报道，该酶系统需要3个独立酶的共同作用，且需要CoA和ATP。本项目将在分离筛选到的15株氯代芳香族杀菌剂百菌清降解菌株和一个全新的、不依赖CoA和ATP的百菌清水解脱氯酶Chd的基础之上，研究不同百菌清降解菌株中水解脱氯酶的差异性，明确影响Chd活性的关键氨基酸位点；研究Chd的催化核心区域、单核还是双核锌离子中心、金属离子的替代性和金属配基结合位点；对Chd进行理性设计和随机改造，获得催化活力增强或底物范围增加的突变体酶，为氯代芳香族化合物的微生物降解提供理论指导和优良材料，具有十分重要的意义。

16株多样的百菌清降解菌株中百菌清水解脱氯酶基因chd高度保守(同源性为99%以上)，来源于8个不同属的代表菌株中chd基因和一个新的插入序列ISOcsp1紧密关联，整个片段高度保守，而且chd基因的启动子位于ISOcsp1的IRR中，显示chd基因的广泛分布是水平转移的结果。毒性抑制实验表明chd基因的水平转移的生态学意义是将百菌清转化为毒性较小的4-羟基百菌清，有助于微生物群落快速适应高浓度百菌清污染环境。. 研究发现Chd的氨基端的15个氨基酸对Chd的催化活性没有影响，但16-50位的氨基酸对于Chd的构象或功能是必需的。定点突变实验表明H128，H157，D45，D130，D184，W241，S126和G208为Chd催化活性所必需。. 利用电感耦合离子发散光谱仪证明Chd的金属中心是一个双锌（Zn2+-Zn2+）结构。结合定点突变，确定了金属结合位点是H128、H131、N230、D130和H271。利用螯合透析，再混合温育的实验方法，发现Zn2+, Co2+, Cd2+, Mn2+能不同程度恢复脱金属辅基酶（apo-Chd）脱氯活性。重组Zn2+-Chd的酶活力与天然酶活力相当；Co2+-Chd的酶活比Zn2+-Chd的酶活提高了20%；而Cd2+-Chd和Mn2+-Chd的酶活比Zn2+-Chd酶活都有下降，分别为原来的91.6%和57%。. 通过易错PCR方法，获得了4个活力提高的Chd突变体，发现总共有7个氨基酸位点发生了突变， 突变体TB-1的比酶活提高了2.5倍。将活力提高的突变子用DNA shuffling的方法进行片段重组，获得突变体TB-5，其比酶活提高了3.7倍。测序结果显示有3个氨基酸位点发生了突变，分别是Q146R、N168Y和S303G。. 通过项目研究，共发表SCI 论文10篇；申请国家发明专利2项；培养博士、硕士研究生5名。. 项目累计拨入经费35万元，支出35万元，项目收支平衡，经费使用合理。