鱼腥藻脂肪氧合酶催化机制及其分子改造研究

Lipoxygenase (LOX) plays a dual role as both bleaching and gluten strengthening, so that it could replace chemical flour improver. In previous work, we selected mutants with increased thermos-stability and catalytic activity through directed evolution of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 (Ana-LOX), however, the catalytic mechanism is not clear. The projects aims to study characteristics of substrate entrance and product release, determine the binding mode of enzyme and substrate by preparation crystals of Ana-LOX and its enzyme-substrate complex, and analyze crystal structure through X-ray diffraction., and finally elucidate the catalytic mechanism of Ana-LOX and fill in the blanks of its structural information and catalytic mechanism at home and abroad. Moreover, we use molecular docking and molecular dynamics simulation methods to explore the interaction between amino acid residues around active site and substrate and analyze related amino acid residues of active site in catalytic channel. To verify the function of target sites, we employ rational and semi-rational strategy, especially site-directed and combinatorial active-site saturation test (CAST) to obtain mutants which catalytic ability significantly improved. In the meantime, we analyze structure activity relationship based on variation of mutants. All these results can be used to investigate the molecular mechanism which affect Ana-LOX catalytic efficiency, and provide scientific theory basis of LOX molecular engineering and enzymology theory.

脂肪氧合酶(LOX)对小麦面粉具有强筋和漂白双重作用，可替代化学合成的面粉改良剂。前期研究中，通过定向进化鱼腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）获得热稳定性和催化活性同时提高的突变体，但其催化机制尚不明确。本项目旨在通过制备Ana-LOX晶体及其与底物复合物的晶体，利用X-射线衍射法解析Ana-LOX晶体结构，研究其底物进入和产物释放通道的特点，确定酶与底物结合模式，阐明Ana-LOX催化机制，填补了国内外Ana-LOX结构信息和催化机制研究的空白。在此基础上，采用理性和半理性设计Ana-LOX催化活性改造策略，通过分子对接、分子动力学模拟等计算机辅助方法，探究酶活性中心氨基酸残基与底物之间的相互作用，确定关键催化氨基酸位点，并利用定点突变和组合活性位点饱和突变技术，获得催化活性显著提高的突变体，进一步揭示影响其催化效率的分子机制，为LOX的分子改造和酶学理论提供科学依据。

脂肪氧合酶(LOX)对小麦面粉具有强筋和漂白双重作用，可替代化学合成的面粉改良剂。.前期研究中，通过定向进化鱼腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）获得热稳定性和催化活性同时提高的突变体，但其催化机制尚不明确。本课题对脂肪氧合酶的晶体制备及结构解析进行了深入研究以阐明其催化机制：（1）Ana-LOX晶体制备。采取多种策略改善Ana-LOX酶蛋白贮藏稳定性差、易降解等问题。首先，更换表达载体以降低载体上融合蛋白对酶蛋白稳定性的不利影响；其次，构建Ana-LOX失活突变体以改变其活性中心构象，同时构建Ana-LOX的N端截短突变体以提高酶分子自身的结构稳定性；此外，改善酶蛋白微环境因素，调整养晶温度、沉淀剂浓度、缓冲液、以及蛋白浓度，从而提高酶蛋白的贮藏稳定性，延缓养晶过程中的蛋白降解。（2）Ana-LOX晶体衍射与结构解析。将获得的野生型Ana-LOX及其各种突变体晶体进行X射线衍射，晶体衍射分辨率均较低（> 4Å），由于Ana-LOX与其已知结构的同源蛋白相似性最高不足24%，无法通过分子置换法解析其结构。（3）PLAT-LOX融合蛋白及其突变体的构建以及晶体制备。Ana-LOX晶体衍射分辨率低可能与Ana-LOX的结构稳定性较差有关，因此，进一步尝试在Ana-LOX的N端加入PLAT结构域以稳定其整体结构。在此基础上，构建Ana-LOX半胱氨酸突变体C490A，阻止蛋白质分子间二硫键的形成而防止无规则聚集，使其可以规则地排列，从而获得待衍射的Ana-LOX突变体晶体。（4）褐鼠肠弧菌脂肪氧合酶（En-LOX）晶体结构解析及其在面粉中的应用研究。从NCBI基因库中挖掘有较高应用价值且同源性较低的细菌来源的脂肪氧合酶。其中，将表达水平高且性质稳定的En-LOX进行面粉中的应用研究，发现其具有强筋作用。培养获得了野生型En-LOX及失活突变体En-LOX-H409A晶体，其衍射分辨率大于7 Å，仍需进一步优化以提高分辨率。（5）葛仙米脂肪氧合酶（Ns-LOX）分子改造及其晶体结构分析。挖掘并表达纯化酶活力较高的Ns-LOX，经半理性设计提高了该酶的热稳定性，并培养得到衍射分辨率为3~5 Å的单晶。目前，脂肪氧合酶的晶体衍射及其结构解析工作仍在进行中，基于脂肪氧合酶结构的催化机制解析及提高催化活性的分子改造有待于进一步探索。