牛源牛分枝杆菌的MIRU-VNTR法分型鉴定及其对主要免疫细胞的功能影响研究

In recent years,epizootic cases of bovine tuberculosis has been increased gradually in China. Bovine tuberculosis(TB) can lead to not only huge loss,but also serious threat to human health. In this study, we will research on epidemiology of TB in part areas of China by using the method of MIRU-VNTR, a molecular biological identification technique,in order to analyze relativity of TB pathgens and its molecular pathogenic features. Marcophage and dendritic cell play an important role in anti-infection caused by M.bovis(M.b). Up to now, there are little studies on features and mechanisms of anti-infection for the both immune cells induced by M.b with different virulence and infection loading. In this study, different cell models, such as bovine marcophage, mice marcophage line ANA-1, mice dendritic cell line DCs will be used and stimulated by reference and isolated M.b. strains with different virulence and infection loading. The apoptosis features, generation and regular effect of associated cytokines, regular changes of some important index will be researched for the cells mentioned above in vivo and in vitro, when some kinds of technic and methods involved in molecular etiology, cellular biology, biological chemistry, immunology and immunological pathology can be carried out in these experiments. The study provides not only a new field of view to further research anti-infection mechanism of marcophage and dendritic cell stimulated by Mycobacteria bovis with different virulence and infection loading,but also an important technical support in prevention and control of bovine tuberculosis. Meanwhile, this study provide an important basis on understanding pathogenic mechanism of M.b,the mecganism of anti-infection and apoptotic rugularity of marcophage.

近年来,我国牛结核的流行有回升势头，疫情不容忽视。本研究采用分子生物学鉴定技术对牛结核病的开展流行病学及分子流行病学研究，应用基因分型方法多位点结合—数目可变重复片段多态性分析（MIRU-VNTR）对牛结核病原菌进行分型鉴定。分析牛结核病病原的相关性及分子病原学特性。同时，本研究分别以结核病牛及PPD阳性牛的单核细胞牛巨噬细胞、小鼠单核细胞系ANA-1及小鼠的树突状细胞系DCs作为细胞模型，采用已鉴定的牛分枝杆菌分离株及参考菌株进行感染试验。了解不同毒力牛结核杆菌抗感下，上述细胞的凋亡特点、相关细胞因子的产生及作用规律、抗结核感染的一些重要指标的变化规律等，为研究主要免疫细胞的抗结核杆菌感染机制提供新视野，对开展有效的牛结核预防及免疫策略提供技术支持。同时，对从细胞生物学、免疫学等层面了解牛分枝杆菌致病机理、免疫细胞抗感染机制、宿主细胞的凋亡规律及树突状细胞的功能变化规律奠定了基础。

本研究对分离自宁夏和新疆为主的西北部分地区规模化奶牛场中PPD阳性奶牛的疑似致病菌，采用多位点PCR进行菌种鉴定；利用MIRU-VNTR基因分型技术探究牛源分离株的基因型；运用基因测序技术，探究西北五省非结核分枝杆菌（NTM)的种类，为西北地区控制牛结核病提供可靠的病原学及流行病学理论依据。聚类分析15个MIRU-VNTR位点的基因分型结果，30株结核分枝杆菌聚集成四个基因群，呈现出18种VNTR基因型，其中14株为单一基因型，即一株菌代表一种基因型，占所有菌株的46.7%；16株（53.3%）聚集成4个基因簇，即C1、C2、C3、C4，每一簇分别包含3、2、5、6株分离株，菌株成簇率为46.7%。最大的基因群（均为新疆株）包含C3和C4基因簇，该基因群包含的菌株可能是新疆地区的优势菌株。.本课题探究小鼠髓源树突状细胞（ BMDC）感染牛分枝杆菌后，cGAS信号通路的表达，以及对BMDC成熟及活化的调控，进一步探究感染后CD4+ T细胞的免疫应答。 利用体外诱导的方法，原代分离BMDC。通过Western blot检测感染后BMDC中cGAS及其下游相关蛋白的表达情况，利用免疫荧光显微镜观察IRF3的入核现象。利用流式细胞术以及Ⅰ型干扰素受体阻断剂，检测感染后BMDC表面标志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ的表达情况，利用ELISA试剂盒检测细胞上清中IFN-β、IL-12p70、IL-10、IL-6、TNF-α的分泌情况。结果显示，感染后表面标志物表达量显著上升，而cGAS沉默后以及Ⅰ型干扰素受体阻断后，表达量均受到抑制。细胞因子的变化趋势基本与之相同，但TNF-α不受阻断剂的影响。添加外源性IFN-β后TNF-α、IL-12p70分泌量上调，而IL-10、IL-6则无明显变化。建立了BMDC与CD4+ T细胞共培养体系，通过流式细胞术和ELISA技术分别检测CD4+ T细胞的增殖情况以及IFN-γ的分泌。.本研究表明，cGAS信号通路存在于BMDC中，感染牛分枝杆菌后cGAS及下游相关蛋白可被激活，并且cGAS信号通路以及Ⅰ型干扰素途径有助于BMDC表型的成熟和功能的活化，对抗原呈递起到促进作用。此外牛分枝杆菌感染BMDC后，可显著增强CD4+ T细胞的扩增能力，提高IFN-γ的分泌量，诱发获得性免疫应答。