牛分枝杆菌多价DNA疫苗的免疫研究

牛结核病主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人兽共患传染病。虽然接种卡介苗可产生一定的免疫保护作用，但是，牛接种卡介苗后，会干扰牛PPD的变态反应检测，导致人工免疫和自然感染无法区别，影响牛的检疫和国际贸易，因此，目前该病尚无有效的预防疫苗。随着分子生物学技术的发展，尤其是DNA疫苗的问世，为牛结核病的检测和预防提供了新的途径。DNA疫苗的突出优点是接种的动物不产生变态反应，即注射牛分枝杆菌DNA疫苗后，仍可采用牛分枝杆菌PPD进行变态反应检疫。本研究是在已获得的牛分枝杆菌主要保护性抗原基因及其免疫原性，以及表达产物的基础上，构建主要保护性抗原基因的二价或多价及与细胞因子共表达的分泌型高效真核表达载体，并在哺乳动物细胞中表达。以该分泌型真核表达重组质粒免疫实验动物，检测其免疫效果和免疫保护作用，以期从中筛选出能够预防牛结核病的新型多价DNA疫苗。

以牛分枝杆菌保护性抗原基因mpb51、mpb63、mpb64、mpb70、mpb83、esat6、cfp10、ag85a、ag85b为模板，通过SOE PCR将2、3、4个保护性抗原基因彼此相互融合，分别获得了15个、24个、32个融合基因，将各融合基因连接至原核表达载体pET28a/pET30a/pET22b/pET32a中，在大肠杆菌中获得了表达，并纯化了部分融合蛋白，为研究各融合蛋白的免疫生化特性及作为检测试剂奠定了基础。以PHA诱导的牛外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增了IFN-γ、GM-CSF、IL-2、IL-6、IL-10、IL-15、IL-18基因，并通过SOE-PCR与获得的牛分枝杆菌双价融合基因融合，获得了28个融合基因。在真核表达载体pVAX1 CMV启动子后，插入BM40信号肽基因序列，构建了分泌型表达载体pVAX1-BMS。将各融合基因插入到表达载体pVAX1-BMS中，获得了88个多基因融合的真核表达重组质粒，经荧光抗体检测证实融合基因在Mark145细胞中获得了表达。以多基因融合真核表达重组质粒对小鼠进行了免疫，检测结果显示，与pVAX1-BMS和生理盐水对照组相比，免疫小鼠体内产生了抗原特异性的IgG，脾细胞中产生IFN-γ、IL-12的细胞数量存在显著差异（P﹤0.05），但均不及BCG免疫组；多基因融合免疫组的CD3+T细胞数量均高于对照组，但未达到统计学的显著水平，与BCG免疫组间也无显著差异，BCG免疫组与对照组差异显著（P＜0.05）；在CD8+T细胞数量上，大部分多基因融合免疫组高于生理盐水免疫组，但未达到统计学显著水平，少数多基因融合免疫组显著高于生理盐水免疫组（P＜0.05），且与BCG免疫组相当。研究结果表明，牛分枝杆菌多基因重组质粒能够刺激免疫小鼠产生特异性的体液免疫和较高水平的细胞免疫。本研究为进一步研究这些融合基因的免疫保护作用，从而研制出牛结核病新型、高效DNA疫苗奠定了基础。