Sulfatase 2 对肝癌细胞自噬的抑制作用及其机制的研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of most common cancers, and its mechanism is still not very clear. Sulfatase 2 (SULF2) as a new discovered oncogene is involved in the development of many cancers. Our previous data showed SULF2 can promoted HCC cells proliferation and tumorigenesis, and recently we found SULF2 inhibited autophagy. Autophagy is an essential cellular process involving self-degradation of intracellular components via the lysosome, which plays an important role in cancer initiation and progression. This suggests SULF2 may be take its effect through inhibiting autophagy. The overall goal of our research is to understand the following questions: (1) clarifying SULF2 can inhibit HCC cells autophagy. (2) clarifying the effect of SULF2 on cells through inhibiting autophagy. (3) clarifying the mechanism of SULF2 inhibiting autophagy. (4) observing the effect of SULF2 on HCC through inhibiting autophagy in vivo. Finally, we can get the mechanism of SULF2 inhibiting autophagy and its effect on HCC cells. This may be a new important mechanism of HCC development, and supply new theories for HCC research.

肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病机理目前尚未阐明。人硫酸酯酶2（Sulfatase 2, SULF2）作为新发现的癌基因可参与多种恶性肿瘤的发生。我们前期研究发现SULF2促进肝癌细胞增殖及肿瘤形成，最近又首次发现SULF2可抑制肝癌细胞自噬，而自噬作为亚细胞降解途径参与细胞的代谢和生存，其调节异常与肿瘤的发生发展密切相关，因此我们推测SULF2可能通过抑制自噬发挥其作用。为此本课题拟进行四方面的研究：（1）明确SULF2可抑制肝癌细胞自噬；（2）明确SULF2抑制自噬对细胞表型的影响；（3）探讨SULF2影响肝癌细胞自噬的主要机制；（4）在体观察SULF2通过抑制细胞自噬对肝细胞癌的影响。经综合分析，明确SULF2对肝癌细胞自噬的抑制作用及其机制，这可能是肝癌发生发展的一个新的重要分子机制，阐明此分子机制，可能为肝癌的防治找到新的分子靶点，为肝癌的研究提供新的理论基础。

人硫酸酯酶2（sulfatase 2，SULF2）可以通过肝素结合性生长因子使硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)脱硫酸化。前期研究证明了SULF2通过激活FGF和Wnt途径在肝癌发生中发挥癌基因作用。自噬在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，同时也收到生长因子的调控，因此说明自噬和SULF2之间可能存在交叉对话，但尚没有关于SULF2与自噬作用的研究。本研究使用SULF2阴性的Hep3B细胞转染SULF2表达质粒，使用SULF2发表达的Huh7细胞转染shRNA，作为研究对象，并通过饥饿培养法诱导细胞自噬。分别使用western blot、共聚焦显微镜和电镜的方法检测LC3B蛋白、GFP-LC3分布、自噬小体形成。并观察低血清培养下细胞的增殖活性、迁徙能力和凋亡状态。应用western blot方法检测AKT/mTOR通路变化，同时分别使用PI3K抑制剂LY294002及mTOR抑制剂雷帕霉素，进一步检测AKT/mTOR通路及自噬变化。体内实验采用裸鼠肝脏注射SULF2过表达的Hep3B细胞进行成瘤实验，观察肿瘤状态及转移情况，并通过RT-PCR检测肿瘤组织的Beclin-1的mRNA表达，通过western blot检测肿瘤组织中p-AKT及p-mTOR的蛋白水平。结果显示：无论是在SULF2过表达的Hep3B细胞还是SULF2抑制的Huh7细胞，SULF2都表现出抑制自噬的作用，这种抑制作用在饥饿培养的细胞更为明显。SULF2的抑制自噬作用，造成低血清培养的Hep3B及Huh7细胞增殖活性降低、迁徙能力下降、cleaved caspase-3表达增高，凋亡明显。机制研究显示了转染了SULF2的Hep3B细胞的p-AKT、p-mTOR 及mTOR d下游因子 p-ULK1, p-P70S6K和 p-4E-BP1均表达上调；相反在SULF2抑制的Huh7细胞中，以上因子均下调；PI3K抑制剂LY294002及mTOR抑制剂雷帕霉素能阻断SULF2的抑制自噬作用。动物体内实验显示肿瘤组织的beclin-1 mRNA表达上调，p-AKT及p-mTOR的蛋白水平增加，进一步说明SULF2能够激活AKT/mTOR通路抑制自噬。结论：SULF2能够通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制肝癌细胞自噬，并降低肝癌细胞的增殖活性，诱导凋亡发生。本研究可能为肝癌的防治提供新的分子靶点。