柱花草炭疽菌致病相关基因的克隆及功能分析

柱花草（Stylosanthes spp.）是热带地区栽培面积最大、我国南方广为种植的优良高蛋白豆科牧草、绿肥和水土保持植物。炭疽病是目前严重危及柱花草生产的主要病害。本研究旨在对柱花草炭疽病病原生物学、遗传多态性和流行学深入研究的基础上，利用农杆菌介导的T-DNA插入突变技术，构建一个在T-DNA片段中含有抗潮霉素基因的质粒载体，建立高效的转座子插入转化体系，通过病原大规模插入突变，筛选与炭疽病致病相关的转化突变体，建立10000个以上转化体的突变体库，对突变体进行致病力鉴定，利用Tail-PCR分离、克隆致病相关基因，并进行基因功能分析，为从全基因组水平上研究柱花草胶孢炭疽菌关键致病基因的功能，探索其致病分子机制，以及柱花草和其他作物炭疽病防治提供分子基础和理论依据。

本研究采用根癌农杆菌介导的转化方法，选取含有氯嘧磺隆抗性标记的ILV1基因和报告基因GFP二元载体的农杆菌AGL-1，对柱花草炭疽病菌CH008进行遗传转化，优化获得了根癌农杆菌AGL-1介导的柱花草炭疽菌CH008高效遗传转化体系，转化效率可达300～400个转化子/106个炭疽孢子。即根癌农杆菌AGL-1浓度OD600 = 0.8，炭疽菌分生孢子浓度为1×106个/ml，AS浓度为100mmol/L，诱导时间为6h，共培养温度和时间分别为25℃和3d。利用该遗传转化体系，获得10521个柱花草炭疽菌遗传转化子。.从柱花草炭疽菌遗传转化子库中随机挑选30个转化子进行了PCR检测，均可检测到GFP基因特异片段，且均能观察到绿色荧光蛋白的表达；选取其中的9个转化子进行Southern杂交分析，发现转化子单拷贝插入的比例约为67%。转化子连续转接培养10代的稳定性检测结果发现，转化子仍具有氯嘧磺隆抗性，具有较高的遗传稳定性。.研究和建立了柱花草炭疽菌转化子致病性测定筛选方法，即通过离体叶片针刺菌饼接种法和盆栽苗喷雾接种法，对感病品种AFT3309及国际通用测定品种endeavour， Schofield，Cook，Graham，Oxley，Fitzroy的健康幼嫩植株进行了致病性测定，我们随机挑选3510个转化子进行了筛选，共获得致病性缺陷型突变菌25株，其中致病力减弱突变株18株，致病性完全丧失突变株6株。进一步利用TAIL-PCR技术对其中的16株突变株的T-DNA插入位点侧翼序列进行扩增，获得了6个突变株的插入位点侧翼序列，结果发现，致病力缺失突变体菌株t-2430的插入位点序列与稻瘟菌中编码天冬氨酸转移酶基因的同源性为79%，致病力缺失突变体菌株t-621的插入位点序列的3-端与稻瘟菌中编码乙酰乳酸合成酶基因部分序列完全一致。其他4个侧翼序列在进一步分析中。