希金斯刺盘孢致病相关基因的克隆及功能分析

十字花科蔬菜炭疽病是由希金斯刺盘孢引起的一类世界性植物真菌病害，但目前有关该病病原的致病分子机制研究相对较少。前期研究中，我们从构建的希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体库中筛选到一类可引起寄主细胞过敏性坏死的致病缺陷型突变体；该类突变体接种拟南芥活体叶片后肉眼观察不到病斑，但在拟南芥细胞中可形成各种侵染结构，次生菌丝被限制在数个细胞中不能扩展并伴有细胞过敏性坏死反应发生。本研究拟重点选用T-DNA单拷贝插入突变体Ch-1-E590和Ch-1-T679为研究材料，采用反向PCR等技术克隆致病相关基因，通过基因敲除和基因互补策略研究基因的生物学功能，并进一步利用编码蛋白亚细胞定位、表皮细胞瞬时表达、实时定量PCR等技术分析基因与拟南芥抗病信号传导途径的作用关系。该研究有利于从细胞和分子水平上认识希金斯刺盘孢的致病机理，对于寻找和利用希金斯刺盘孢特异性分子靶标进行病害控制具有重要的理论价值。

十字花科蔬菜炭疽病是由希金斯刺盘孢引起的一类世界性植物真菌病害，目前鲜见病原致病相关基因的功能研究。本项目以3个致病缺陷突变体为材料，阐明了3个致病相关基因新的生物学功能。Ch-MEL1基因在希金斯刺盘孢中可调控分生孢子萌发、黑色素合成以及侵染菌丝的形成。Ch-MEL1基因比对发现仅与4种真菌的假定蛋白具有较高同源性。野生型菌株与互补转化子菌落呈黑褐色，敲除转化子为玫红色。在疏水玻片上敲除转化子孢子萌发率显著降低，仅产生白化附着胞，接种拟南芥无伤和针刺叶片，4 d后均未观察到病斑；互补转化子和野生型菌株表现正常；显微观察表明，孢子萌发产生的附着胞不能正常黑化，且菌丝不能进入伤口完成侵染。RT-PCR分析发现Ch-MEL1基因在分生孢子萌发（5 hpi）、附着胞产生（22 hpi）、活体营养（40 hpi）和死体营养（72 hpi）阶段均能表达。Ch-MEL1基因的缺失影响SCD1基因正常表达，不影响PKS1和THR1基因表达。Ch-RasGEF基因参与调控希金斯刺盘孢菌丝生长、产孢及孢子附着。在希金斯刺盘孢全基因组数据中Blastp搜索发现五个RasGEF同源蛋白序列，构建系统进化树表明它们分别位于进化树的不同分支。敲除转化子菌落生长速度、生物量和产孢量显著下降，敲除转化子接种拟南芥叶片4d后未见发病，显微观察发现附着胞形成率显著降低；而互补转化子表型正常。经尼罗红染色野生型菌株和互补转化子分生孢子中脂质体分散分布，而敲除转化子脂质体在孢子中聚集；敲除转化子胞内cAMP水平显著低于互补转化子，约下降70%；外源添加IBMX，敲除转化子孢子上芽管萌发正常，33%形成类似附着胞结构。Real-time PCR检测表明，Ch-RasGEF基因在离体孢子阶段表达量较高（0h）并在附着胞形成阶段（20h）大量表达。Ch-MFS1基因与产孢、菌丝形态及侵染能力密切相关。基因与Major facilitator superfamily transporter同源性达75%。与野生型菌株类似，互补转化子生长7 d菌落呈黑褐色，可产生大量分生孢子。扫描和投射电镜观察发现，互补转化子菌丝形态得到恢复，畸形泡状菌丝发生频率大幅下降。互补转化子接种6d后拟南芥幼苗呈水渍状病斑；接种形成的分生孢子盘数量是突变体Ch-1-T513的10-15倍。