nox1基因对单增李斯特菌菌膜形成及毒力调控机制

Environmental stresses force bacteria gathering and actively form biofilm which is composed of glycoprotein. The bioflim is a bacterial character of drug resistance and survival strategy through those extreme environments. Planktonic bacteria that are released from biofilm show higher drug resistance and invasion abilities than normal bacteria. Hence, it has been an unsolved difficulty on food pathogenic bacteria control, infectious disease treatment for long time. Many researches suggest that bacteria under stress can release reactive oxygen species that is closely related with biofilm formation and virulence of bacteria. Reactive oxygen species are known to be expressed by nox gene family in human cells and play important role as cell signaling molecule. However, nox genes are barely reported in bacteria field. We hypothesize nox genes derived active oxygen species, is the key point of bacteria biofilm forming and virulence when bacteria face environmental stress. This study chooses Listeria monocytogenes as model, applied system research on noxs gene subtype, protein localization, reactive oxygen species of Listeria monocytogenes. And mechanism of biofilm formation will be explored through the noxs knockout and over expression strategies, bacterial virulence gene regulation will be investigated with microarray study, and the regulation of biofilm on bacterial virulence will also examine by cell toxicity and animal studies. The target of our study is to provide new clues for food microorganism's resistance control in food safety realm.

环境胁迫下细菌聚集产生糖蛋白菌膜得以生存，胁迫解除后菌膜释放的浮游菌抗药性、侵染力增强，是食源性致病菌检测、抗药性、临床治疗的难题。最新研究提示环境胁迫下细菌内产生的活性氧和菌膜形成、毒力提升相关，但这些活性氧的来源，以及和专门产生活性氧的noxs基因之间的关系，尚无明确报道。我们假设：胁迫环境可瞬时激活细菌中的noxs基因，由其介导产生的活性氧是菌膜、毒力基因调控的关键靶点。选择单增李斯特菌为模式菌，在前期noxs及ROS研究的基础上，首先对该菌中noxs亚型、蛋白定位、活性氧产生进行深入研究；再通过noxs基因敲除、过表达、基因微阵列技术，重点研究noxs对27个细菌毒力基因、7个菌膜形成关键蛋白的调控；最后通过细胞、动物毒力实验评估noxs及其介导产生的ROS对浮游菌毒力的调控作用，通过以上研究综合判定noxs基因对菌膜形成及毒力调控的分子机制，为致病菌防控、检测、预警提供理论支持。

环境胁迫下细菌聚集产生的由糖蛋白组成的菌膜（Biofilm，BF），是细菌抗药性及度过极端环境的生存策略，菌膜释放的浮游菌抗药性、侵染力增强，是食品致病菌控制、感染性疾病治疗的难点，最新研究提示环境胁迫下细菌内产生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和菌膜形成及毒力调控相关。noxs基因是高等动植物细胞Ros产生关键基因，其介导产生的活性氧是重要的信号分子，但细菌中noxs表达及功能报道极少。我们的研究提示：在不影响细菌的生长和活性的前提下，在菌膜的初始粘附期和成熟期，nox的抑制剂DPI降低单增李斯特菌野生株EGDe的ROS生成量，但BF的形成增加，在菌膜的成熟期，DPI对EGDe菌株的内外活性氧总和没有影响，但降低了细菌内部的ROS；通过nox基因敲除构建突变株EGDe-△nox，ROS测定表明nox基因缺失会降低ROS的生成，在BF实验中，同等条件下EGDe-△nox的BF量比EGDe的多，即ROS产生降低而BF产量增加；在nox基因毒力基因的调控方面，表达谱芯片检测结果表明，nox缺失后约有1250个基因表达下调，但毒力基因inlA、hly的表达上调，在nox过表达后包括毒力基因在内几乎所有基因全部上调；当抑制剂抑制细菌ROS后侵袭细胞，HepG2及Caco-2细胞的炎症因子TNFα、IL-β发现有明显上调，IL-8、IL-6、IL-10、IL-12p70则下调或无变化；nox基因与单增李斯特菌致病机理研究表明：被EGDe, EGDe-△nox，EGDe-perl3及EGDe-nox侵袭后HepG2及Caco-2细胞活性氧的变化情况，发现宿主细胞被侵袭后普遍ROS水平有所提高，被EGDe-△nox侵袭后，细胞ROS水平上升最小，说明nox基因的缺失会滞后宿主细胞NADPH oxidase的应激反应。除此之外，我们构建了Lm毒力基因缺失菌株，对缺失菌株的毒力以及免疫原性进行测定，结果显示毒力缺失菌株的细胞侵袭能力，胞内增殖能力以及动物毒性均下降。C57/6脾脏炎症因子检测结果显示EGDe-ΔactA、EGDe-ΔactAinlB能引起TNF-α、IL-1β、IL-6、 IL-17转录，EGDehly仅能引起IL-17、IL-10明显转录，而EGDe-ΔprfA对于检测的炎症因子未见明显变化。