基于蛋白质组学的单增李斯特菌luxS基因调控生物膜形成的机制研究

Listeria monocytogenes is a facultative intracellular Gram positive pathogen, considered as one of the top four food-borne pathogens by WHO. The formation of a biofilm, is thought to be the leading cause for the persistence of L. monocytogenes contamination in the production process of food plants, previous studies reported that the deletion of luxS in L. monocytogenes strains has the ability to enhance biofilm formation. However, little information is available on the molecular regulation mechanism of biofilm formation by luxS gene. We will use a characteristic food-borne L. monocytogenes GIM798 as an original strain, which isolated from Flammulina velutipes product in the previous national investigations of food-borne pathogens contamination in China. In our research we attempt to analyze the intracellular and extracellular protein expression profiles of L. monocytogenes in the exponential phase and the intracellular and extracellular protein expression profiles of L. monocytogtenes in biofilm phase regulated by luxS gene by iTRAQ-labeled comparative proteomics analysis, and screen the differential proteins related to biofilm formation. On the basis of the results of comparative proteomics, we will construct mutant strains of the differential proteins which related to biofilm formation, and then measure the biological parameters of biofilm formation. The resistant abilities of biofilm to disinfectant and ultraviolet radiation are also evaluated. Our study is aim to explore the molecular mechanism of biofilm formation regulated by luxS gene, which will provide a theoretical basis for preventing and controlling the L. monocytogenes biofilm contamination during the production process of food plants.

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM) 是兼性厌氧细胞内寄生革兰氏阳性菌，属于WHO公布的四大食源性致病菌之一。生物膜是LM持续污染食品生产过程的主要因素，luxS缺失导致生物膜形成能力增强，但目前尚未阐明luxS基因对生物膜形成的调控机制。本研究以课题组前期获得的LM特征株GIM798作为出发菌株，在已构建ΔluxS缺失株的基础上利用iTRAQ定量蛋白组学方法比较ΔluxS缺失株、ΔluxS缺失株+AI-2及野生株在对数期游离状态和生物膜状态下的胞内与胞外蛋白质组表达差异，试图阐明luxS基因如何调控蛋白质表达并筛选与生物膜形成相关的差异蛋白。在此基础上，通过同源重组技术构建生物膜形成相关蛋白基因缺失株，综合分析生物膜的各项生物学指标，以期阐明luxS基因调控LM生物膜形成的分子机制，为防止和控制食品生产过程中LM污染提供理论基础。

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要的革兰氏阳性食源性致病菌。生物膜被认为是单增李斯特菌持续污染食品生产过程的重要因素。本项目以实验室前期全国食源性单增李斯特菌风险调查获得的优势株798-1WT作为出发株，成功构建单增李斯特菌ΔluxS、ΔagrD和ΔluxSΔagrD菌株，利用结晶紫染色法分析其生物膜形成能力，结果表明luxS基因扮演负调控的角色，而agrD基因则可能在生物膜形成中起着正调控作用；与野生株相比，在12.5 μmol H2O2剂量下，ΔagrD缺失株抗H2O2胁迫能力显著下降（p<0.05），ΔluxS缺失株在25 μmol H2O2剂量下表现出抗H2O2胁迫能力显著下降（p<0.05），结果表明单基因缺失株抗H2O2的胁迫能力均下降。利用iTRAQ定量蛋白质组学研究游离态和生物膜态下蛋白质组表达的变化，结果表明SigB操纵子、脂肪酸合成酶系、Mpl、inlA、LadR、Dlt操纵子、鞭毛形成相关蛋白和Sod等蛋白表达水平发生显著变化，说明luxS基因在生物膜形成、脂肪酸合成、环境适应和毒力因子表达的生物进程中扮演着重要作用。基于iTRAQ定量蛋白质组学研究结果，我们推测LuxS/AI-2群体感应系统可能通过上调LadR蛋白的表达水平和下调降解c-di-GMP的Lmo0111、Lmo0131和Lmo1914表达水平，从而关联c-di-GMP调控通路影响生物膜的形成。利用基因同源重组技术构建ladR基因突变株，通过结晶紫染色、电子扫描电镜和激光共聚焦显微镜研究ladR基因缺失株生物膜形成能力，结果显示ladR基因突变株的生物膜形成能力显著下降（p＜0.05），表明LadR在单增李斯特菌生物膜形成中起着重要作用。本项目研究结果表明luxS基因缺失株上调LadR蛋白表达水平，同时可能提高胞内c-di-GMP水平，进而影响生物膜的形成。因此，LadR蛋白可能是介导单增李斯特菌LuxS/AI-2群体感应系统调控生物膜形成的主要通路之一，拓展了单增李斯特菌LuxS/AI-2群体感应系统调控生物膜形成的新认知，为开发基于阻断群体感应调控通路的防控新技术提供新思路。