PTS组分MpoB在MV抑制单增李斯特菌菌膜形成中的调控机理

Listeria monocytogenes is one of the important foodborne pathogens that can form biofilm. The mechanism of biofilm formation of the pathogen is not yet clear. Phosphotransferase system (PTS) plays an important role in regulating bacterial growth metabolism and biofilm formation. Our previous studies demonstrated that methyl violet (MV) could significantly inhibit the biofilm formation of L. monocytogenes, and the increased activities of reactive oxygen species (ROS) in cell resulted in the decreased expression level of PTS-MpoB. This project aims to explore the effect and the mechanism of MpoB in MV inhibiting the biofilm formation of L. monocytogenes. First, mpoB deletion mutant and reverse mutant are constructed to analyze the effect of mpoB deletion on oxygen stress resistance, biofilm formation ability and biofilm related physiological properties with/without MV. Second, iTRAQ is used to compare differentially expressed protein profiles of biofilm cells between the wild type and mpoB deletion mutant with MV. Then, the differential expressed proteins are functionally annotated by GO and clustered by KEGG pathway by means of bioinformatics methods. Subsequently, the differential expressions of key proteins are confirmed by RT-qPCR. Lastly, the effect and mechanism of PTS-MpoB in MV inhibiting biofilm formation of L. monocytogenes are elucidated based on the phenotypic changes combined with the pathways containing key differential proteins.

单增李斯特菌（LM）是重要的食源性致病菌，其菌膜形成机理尚未阐明。磷酸转移酶系统（PTS）对细菌的生长代谢和菌膜形成具有重要调控作用。前期研究发现，活性氧组分（ROS）诱导剂甲基紫精（MV）可明显抑制LM菌膜的形成，并且细胞内ROS升高可导致PTS组分MpoB表达量明显下降。为探明MpoB在MV抑制LM菌膜形成中的作用与机理，本项目首先构建mpoB基因缺失突变株和回复突变株，在有/无MV作用下分析该基因对氧胁迫抗性、菌膜形成能力及相关生物特性的影响；其次，利用iTRAQ串联质谱技术，比较MV作用下野生型和突变株菌膜细胞内蛋白的表达差异；然后，借助生物信息学手段对差异蛋白进行GO注释与KEGG通路聚类；随后，通过实时荧光定量PCR技术对关键蛋白的差异表达进行mRNA水平的验证；最后，综合上述表型特征变化与关键差异蛋白所在通路，阐释MpoB在MV抑制LM菌膜形成中的作用与机理。

单增李斯特菌是引起食物中毒的一种重要的食源性致病菌，其菌膜的形成是食品工业面临的一项难题。前期研究我们发现氧化剂甲基紫晶（Methyl viologen，MV）可以明显抑制该菌菌膜的形成，而磷酸转移酶系统（Phosphotransferase system, PTS）中的mpoB基因在菌膜的形成中或许可以起到重要的调控作用。为了验证这一假说，本项目以前期研究所用的单增李斯特菌4b G菌株为实验材料，首先利用同源重组技术构建了该菌mpoB基因的缺失突变株△mpoB，与该基因紧邻的上游基因mpoA的缺失突变株△mpoA，mpoA和mpoB的双基因缺失缺失突变株△mpoAB，以及基因缺失突变株的回复株；其次，通过96孔板结晶紫染色法比较了有无MV存在下野生型与突变株的菌膜形成能力，并对野生型与突变株的生长能力、运动能力、表面疏水性、凝聚能力等菌膜形成相关的生理特征进行了比较；最后，利用TMT技术比较了野生型与突变株的蛋白质谱表达差异，对差异基因进行转录水平的验证。结果显示，在无MV存在下，单基因缺失突变株△mpoB、△mpoA和双基因缺失突变株△mpoAB的菌膜形成能力均明显减少，减少量分别为30.6%、26.1%和31.6%，各突变株之间的菌膜形成能力无明显差别；在MV存在下，野生型与突变株的菌膜形成能力均明显降低，但野生型与突变株的菌膜减少量无明显差异。另外，生理特征分析显示，野生型与突变株除生长能力外，在运动性、表面疏水性以及凝聚能力方面均无明显差别。最后，蛋白质组数据显示，MV可以明显抑制mpoB基因的表达，该基因主要通过正调控细胞的碳代谢、脂肪代谢、微量元素代谢以及脂肪代谢来影响菌膜的形成。综上，本项目为阐释氧胁迫与单增李斯特菌菌膜形成的关系提供了基础数据，为解析氧胁迫下单增李斯特菌菌膜形成的分子机制提供了科学依据。