人新型免疫调节性T细胞功能鉴定及其扩增方案探索

Regulatory T cells (Tregs) are considered to be critical for maintaining self-tolerance and inducing transplant tolerance, and adoptive transfusion of Foxp3+Tregs have shown therapeutic potential in controlling autoimmune diseases and inducing transplantation tolerance. With the development of mechanism of immune tolerance after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, a variety of immune regulation cells have been found involved. Our previous work has found that CD4+CD25-CD69+T cells reduced acute graft versus host disease (aGVHD), which imply them a novel kind of immune regulatory T cells. However, their immunoregulatory function has only been proved in animal experiments, and it has not been proved whether they might have the same function in human, then further mechanism need to be discussed. Therefore, we design to separate CD4+CD25-CD69+T cells through flow cytometry sorting to identify its immunoregulatory function; then, we design to explore expansion methods through cytokines stimulating expansion to discuss their regulatory mechanism, which provides theoretical basis for clinical application of adoptive therapy.

调节性T细胞在免疫自稳、移植免疫耐受中均起到重要免疫调节作用，过继性输注Foxp3+调节性T细胞治疗自身免疫性疾病或诱导移植后免疫耐受取得一定临床疗效。随着异基因造血干细胞移植后免疫耐受机制研究的不断深入，人们发现多种免疫调节细胞参与其中。我们的前期工作通过分析临床资料发现CD4+CD25-CD69+T细胞可降低异基因造血干细胞术后急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发病风险，提示该群细胞可能是一群新型免疫调节性细胞。然而这群细胞的免疫调节功能仅在动物实验中得到证实，其免疫调节机制亦不完全清楚，尚需进一步体外功能实验证实。我们拟通过流式细胞分离技术分选CD4+CD25-CD69+T细胞进行体外功能实验以鉴定其免疫调节功能；并拟采用细胞因子刺激法探索人外周血CD4+CD25-CD69+T细胞扩增方案，以期进一步探讨其免疫调节机制，并为该群细胞过继性治疗的临床应用奠定基础。

调节性T细胞在免疫自稳、移植免疫耐受中均起到重要免疫调节作用，过继性输注经典型Foxp3+调节性T细胞治疗自身免疫性疾病或诱导移植后免疫耐受取得一定临床疗效。随着免疫调节机制研究的不断深入，人们发现CD4+CD25-免疫细胞群组中也含有免疫抑制性细胞成分。动物实验证实CD4+CD25-CD69+T细胞具有免疫抑制功能，而我们的前期工作通过分析临床资料发现异基因造血干细胞移植术（HSCT）后早期外周血CD4+CD25-CD69+T细胞的迅速扩增有助于降低异基因造血干细胞术后急性移植物抗宿主病（aGVHD）的发病风险，提示该群细胞可能是一群新型免疫调节性细胞。在本研究中我们再次证实这群非经典型CD4+CD25-CD69+调节性T细胞在骨髓中具有免疫抑制作用，同时首次证实了该群细胞可能与造血干细胞移植术后白血病复发相关，且该群细胞可能通过非细胞因子依赖途径调控免疫反应。我们通过8色流式细胞仪测定了骨髓中CD4+CD25-CD69+T细胞比例: 1)证实骨髓中存在非经典CD4+CD25-CD69+调节性T细胞，且在我中心GIAC单倍型异基因造血干细胞移植体系（allo-HSCT）中，HSCT后复发受者骨髓该群细胞比例明显增高。2)动态监测HSCT后（+30d，+60d，+90d，+180d，+270d，+360d）受者骨髓中非经典CD4+CD25-CD69+调节性T细胞重建规律：HSCT后受者骨髓中该群细胞比例高于健康供者骨髓中该群细胞比例；HSCT后复发/微小残留病MRD+受者该群细胞比例高于无事件受者。3)HSCT后+60d，+90d 骨髓非经典CD4+CD25-CD69+调节性T细胞比例高于7%是复发高危人群。4）我们初步证实这群非经典CD4+CD25-CD69+调节性T细胞可能通过非细胞因子依赖途径行使免疫抑制功能。我们应用流式细胞分选技术分选了该群细胞，并应用PMA及离子霉素刺激后，测定了IL-2、IL-10及TGF-β的分泌情况，结果提示刺激前后无差异，且健康供者、移植后复发受者及移植后无事件受者之间细胞因子分泌情况无差异。本研究首次证明了非经典CD4+CD25-CD69+调节性T细胞通过非细胞因子依赖途径抑制免疫反应，具有过继性免疫治疗前景。