基于HBC模型的酶高效催化机制研究及其在酶设计中的应用

Enzymatic reactions play vital important roles in controlling and performing most life processes. Enzymatic reactions are about 100 million or even more times faster than their reference reactions in aqueous solution. Studying the mechanism of the enormous catalytic power of enzymes is very important to enzymatic engineering and other relevant fields. It is currently widely accepted that the enormous enzymatic catalytic powers originate from the electrostatic interactions between reactants and enzymes. However, due to the difficulty in obtaining accurate data of the reference reactions, the proposal is not the basis of accurate comparison. In our previous work, we have developed a novel parameter (H-bonding capability, HBC), which can estimate the reduction of free energy barriers (RFEB) contributed by the H-bonds for enzymatic reactions and their reference reactions. The calculated results based on HBC indicate that H-bond interactions are not the main origins of enzymatic reactions, while desolvation plays very important roles. On the basis of our previous findings, this project will build quantitative relationship between HBC and RFEB and then reveal the contribution of H-bonds to the enormous enzymatic catalytic powers. Meanwhile, we will alter the desolvation of some key residues in active centers of enzymes by site-directed mutagenesis in order to probe the effect of desolvation on the enzymatic catalytic power and to reveal that desolvation is also important for the enzymatic catalytic power. This project will improve the proposal that H-bond interactions are the origins of the enormous enzymatic catalytic powers, facilitate understanding the mechanism of enzyme catalysis and provide theoretic and practical guidance for designing potent synthetic enzymes.

酶催化反应对控制大多数生命过程起着非常关键的作用，酶催化反应比其参考反应快近亿倍甚至更多,研究酶高效催化机理对酶工程等领域有很重要的意义。目前普遍认为静电作用是酶高效催化的原因,但由于当前无法准确得到有关参考反应的数据，该学说是建立在没有与参考反应正确对比的基础上。我们已发展了能准确计算参考反应中氢键影响反应活化能的参数—氢键形成能力(HBC)，基于HBC的计算结果表明静电作用并不是酶高效催化的主因，而去溶剂化也起了非常重要的作用。本项目将建立HBC与氢键影响反应活化能的定量关系模型, 以探索酶反应中氢键对其高效催化的贡献。同时在实验上通过氨基酸残基定点突变的方法改变酶活性中心关键基团的去溶剂化程度，以探讨这些基团的溶剂化效应对酶活性的影响,从而揭示去溶剂化对酶高效催化的贡献。本项目将大大推进当前酶高效催化理论的发展,对正确理解酶的催化机制和设计高效人工酶具有非常重要的理论意义和指导意义。

酶高效催化化学反应的原因已被广泛研究了70多年，已发展了很多关于酶高效催化的机理，但这些机理都与很多实验事实相矛盾。本课题通过定性和定量研究分子间作用力对反应活化能和反应速度影响，完善了文献机理并发展了新的酶高效催化的机理。首先，基于氢键形成能力和氢键配对原理，我们建立了分子间作用力影响反应活化能的定量关系模型。验证结果表明通过该模型计算得到的分子间作用力对反应活化能的影响与实验测得的数据非常接近，说明该定量关系模型的准确性高, 能用于酶高效催化机理的研究。然后，基于定量关系模型和实验验证，我们发展了酶降低反应活化能的机理：电荷改变机理。该机理表明酶通过改变反应活性中心的电荷推动反应物的电子从一个原子转移到另一原子，从而降低反应活化能，而分子间作用力（如氢键、静电排斥作用，去溶剂化等）只是电荷变化推动反应电子转移的途径。该机理是目前最全面、唯一不与任何酶催化反应相矛盾的机理，能解释所有文献机理（静电催化机理、去溶剂化机理、电荷排斥机理等）能解释的反应。我们还发现该机理能准确解释金属酶中金属离子高效催化能力，为解释金属酶的高选择性以及研究金属酶的催化提供了理论基础。通过探索了酶反应和溶液中反应的异同，我们发现该机理也适用于溶液中的催化反应，而溶液中的催化效率没有酶的催化效率高的原因是在溶液中不能同时在接受电子中心和给电子中心达到降低活化能的条件。我们还研究了已被广泛接受的过渡态稳定机理和反应态不稳定机理之间的异同，首次提出这两个机理在降低反应活化能的过程中是一致性，其不同之处是反应前达到活化能降低所需条件的时间不一样。我们的研究结果还表明：过渡态稳定不是酶高效催化来源，而是酶催化的必然结果，这一结果将更正了几十年来一直被大家公认的过渡态稳定机理。本项目的成果有助于解决酶催化研究中的一些争论，也有助于研究酶催化反应和设计高效人工酶。